Clivaggio e shuttling nucleo-citoplasmatico della proteina Sirt1, in cellule dicarcinoma mammario MDA-MB231.

Sirt1 è una proteina nota per il suo ruolo di istone deacetilasi NAD+ dipendente che sembra essere coinvoltain una ampia gamma di processi cellulari, quali regolazione genica, controllo dello stato metabolico,meccanismi di sopravvivenza allo stress. Dalla letteratura emergono dati contrastanti concernenti la funzionedi Sirt1 nei tumori, le vengono infatti attribuiti ruoli sia di oncogene che di soppressore tumorale, argomentofortemente dibattuto. A conferma di ciò, la localizzazione subcellulare e la funzione di Sirt1 variano neidifferenti tipi cellulari (1). E’ anche noto che Sirt1 risulta frequentemente clivata in varie linee cellularigrazie ad attività proteolitiche nucleari (2). Questo studio ha lo scopo di identificare lo stato della proteinaSirt1 in cellule di carcinoma mammario MDA-MB231. I nostri risultati dimostrano che Sirt1 risulta espressaa bassi livelli nella forma “full lenght”, mentre si riscontrano alti livelli di sue forme clivate sia nucleari checitoplasmatiche. Sulla base di analisi bioinformatiche sui possibili siti di clivaggio di Sirt1 (Peptide CutterPrediction-ExPASy), abbiamo ipotizzato che alcune delle forme di clivaggio da noi osservate, possano essereattribuite all’azione della caspasi-8. Abbiamo evidenziato all’interno del nucleo di cellule MDA-MB231, laforma procaspasica (55 kDa) accompagnata dalla presenza di frammenti attivi (48-18 kDa). Abbiamo, ancheevidenziato una ulteriore forma della caspasi-8 a maggior peso molecolare (75 kDa) che, secondo datibibliografici, potrebbe essere attribuita ad una forma di sumoilazione, da alcuni indicata come segnale diimport nucleare (3). Abbiamo pertanto effettuato analisi su immunoprecipitati della caspasi-8 sviluppaticontro anticorpo anti-SUMO1, dimostrando che nel nucleo di cellule MDA-MB231, la caspasi-8 è anche informa sumoilata. Allo scopo di dimostrare che i frammenti di Sirt1 da noi osservati, sono effettivamentefrutto dell’azione della caspasi-8, abbiamo trattato le cellule MDA-MB231 con un inibitore generico dellecaspasi (Z-VAD-FMK). I risultati dimostrano il decremento nella frazione nucleare dei livelli di una delleforme di clivaggio di Sirt1, un frammento c-terminale di 65 kDa (p65-Sirt1). Dati preliminari sembranoindicare che il frammento p65-Sirt1 possa essere esportato nel citosol. In cellule MDA-MB231 trattate conLeptomicina B (inibitore dell’export nucleare), analisi di immunofluorescenza e analisi di western blottingeffettuate su frazioni citosolico-nucleari, hanno evidenziato che il frammento p65-Sirt1 decrementa nellafrazione citosolica e si accumula nel nucleo. E’ stato suggerito che frammenti della proteina Sirt1 possanosequestrare il citocromo c svolgendo così un ruolo anti-apoptotico (2). Nostri studi futuri avranno l’obiettivodi verificare tale aspetto.