Clivaggio e shuttling nucleo-citoplasmatico della proteina Sirt1, in cellule di carcinoma mammario MDA-MB231.

Risultato della ricerca: Paper

Abstract

Sirt1 è una proteina nota per il suo ruolo di istone deacetilasi NAD+ dipendente che sembra essere coinvolta in una ampia gamma di processi cellulari, quali regolazione genica, controllo dello stato metabolico, meccanismi di sopravvivenza allo stress. Dalla letteratura emergono dati contrastanti concernenti la funzione di Sirt1 nei tumori, le vengono infatti attribuiti ruoli sia di oncogene che di soppressore tumorale, argomento fortemente dibattuto. A conferma di ciò, la localizzazione subcellulare e la funzione di Sirt1 variano nei differenti tipi cellulari (1). E’ anche noto che Sirt1 risulta frequentemente clivata in varie linee cellulari grazie ad attività proteolitiche nucleari (2). Questo studio ha lo scopo di identificare lo stato della proteina Sirt1 in cellule di carcinoma mammario MDA-MB231. I nostri risultati dimostrano che Sirt1 risulta espressa a bassi livelli nella forma “full lenght”, mentre si riscontrano alti livelli di sue forme clivate sia nucleari che citoplasmatiche. Sulla base di analisi bioinformatiche sui possibili siti di clivaggio di Sirt1 (Peptide Cutter Prediction-ExPASy), abbiamo ipotizzato che alcune delle forme di clivaggio da noi osservate, possano essere attribuite all’azione della caspasi-8. Abbiamo evidenziato all’interno del nucleo di cellule MDA-MB231, la forma procaspasica (55 kDa) accompagnata dalla presenza di frammenti attivi (48-18 kDa). Abbiamo, anche evidenziato una ulteriore forma della caspasi-8 a maggior peso molecolare (75 kDa) che, secondo dati bibliografici, potrebbe essere attribuita ad una forma di sumoilazione, da alcuni indicata come segnale di import nucleare (3). Abbiamo pertanto effettuato analisi su immunoprecipitati della caspasi-8 sviluppati contro anticorpo anti-SUMO1, dimostrando che nel nucleo di cellule MDA-MB231, la caspasi-8 è anche in forma sumoilata. Allo scopo di dimostrare che i frammenti di Sirt1 da noi osservati, sono effettivamente frutto dell’azione della caspasi-8, abbiamo trattato le cellule MDA-MB231 con un inibitore generico delle caspasi (Z-VAD-FMK). I risultati dimostrano il decremento nella frazione nucleare dei livelli di una delle forme di clivaggio di Sirt1, un frammento c-terminale di 65 kDa (p65-Sirt1). Dati preliminari sembrano indicare che il frammento p65-Sirt1 possa essere esportato nel citosol. In cellule MDA-MB231 trattate con Leptomicina B (inibitore dell’export nucleare), analisi di immunofluorescenza e analisi di western blotting effettuate su frazioni citosolico-nucleari, hanno evidenziato che il frammento p65-Sirt1 decrementa nella frazione citosolica e si accumula nel nucleo. E’ stato suggerito che frammenti della proteina Sirt1 possano sequestrare il citocromo c svolgendo così un ruolo anti-apoptotico (2). Nostri studi futuri avranno l’obiettivo di verificare tale aspetto.
Lingua originaleItalian
Stato di pubblicazionePublished - 2013

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year = "2013",
language = "Italian",

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TY - CONF

T1 - Clivaggio e shuttling nucleo-citoplasmatico della proteina Sirt1, in cellule di carcinoma mammario MDA-MB231.

AU - Vento, Renza

AU - Montalbano, Mauro

AU - De Blasio, Anna

AU - Di Fiore, Riccardo

AU - Marcatti, Michela

PY - 2013

Y1 - 2013

N2 - Sirt1 è una proteina nota per il suo ruolo di istone deacetilasi NAD+ dipendente che sembra essere coinvolta in una ampia gamma di processi cellulari, quali regolazione genica, controllo dello stato metabolico, meccanismi di sopravvivenza allo stress. Dalla letteratura emergono dati contrastanti concernenti la funzione di Sirt1 nei tumori, le vengono infatti attribuiti ruoli sia di oncogene che di soppressore tumorale, argomento fortemente dibattuto. A conferma di ciò, la localizzazione subcellulare e la funzione di Sirt1 variano nei differenti tipi cellulari (1). E’ anche noto che Sirt1 risulta frequentemente clivata in varie linee cellulari grazie ad attività proteolitiche nucleari (2). Questo studio ha lo scopo di identificare lo stato della proteina Sirt1 in cellule di carcinoma mammario MDA-MB231. I nostri risultati dimostrano che Sirt1 risulta espressa a bassi livelli nella forma “full lenght”, mentre si riscontrano alti livelli di sue forme clivate sia nucleari che citoplasmatiche. Sulla base di analisi bioinformatiche sui possibili siti di clivaggio di Sirt1 (Peptide Cutter Prediction-ExPASy), abbiamo ipotizzato che alcune delle forme di clivaggio da noi osservate, possano essere attribuite all’azione della caspasi-8. Abbiamo evidenziato all’interno del nucleo di cellule MDA-MB231, la forma procaspasica (55 kDa) accompagnata dalla presenza di frammenti attivi (48-18 kDa). Abbiamo, anche evidenziato una ulteriore forma della caspasi-8 a maggior peso molecolare (75 kDa) che, secondo dati bibliografici, potrebbe essere attribuita ad una forma di sumoilazione, da alcuni indicata come segnale di import nucleare (3). Abbiamo pertanto effettuato analisi su immunoprecipitati della caspasi-8 sviluppati contro anticorpo anti-SUMO1, dimostrando che nel nucleo di cellule MDA-MB231, la caspasi-8 è anche in forma sumoilata. Allo scopo di dimostrare che i frammenti di Sirt1 da noi osservati, sono effettivamente frutto dell’azione della caspasi-8, abbiamo trattato le cellule MDA-MB231 con un inibitore generico delle caspasi (Z-VAD-FMK). I risultati dimostrano il decremento nella frazione nucleare dei livelli di una delle forme di clivaggio di Sirt1, un frammento c-terminale di 65 kDa (p65-Sirt1). Dati preliminari sembrano indicare che il frammento p65-Sirt1 possa essere esportato nel citosol. In cellule MDA-MB231 trattate con Leptomicina B (inibitore dell’export nucleare), analisi di immunofluorescenza e analisi di western blotting effettuate su frazioni citosolico-nucleari, hanno evidenziato che il frammento p65-Sirt1 decrementa nella frazione citosolica e si accumula nel nucleo. E’ stato suggerito che frammenti della proteina Sirt1 possano sequestrare il citocromo c svolgendo così un ruolo anti-apoptotico (2). Nostri studi futuri avranno l’obiettivo di verificare tale aspetto.

AB - Sirt1 è una proteina nota per il suo ruolo di istone deacetilasi NAD+ dipendente che sembra essere coinvolta in una ampia gamma di processi cellulari, quali regolazione genica, controllo dello stato metabolico, meccanismi di sopravvivenza allo stress. Dalla letteratura emergono dati contrastanti concernenti la funzione di Sirt1 nei tumori, le vengono infatti attribuiti ruoli sia di oncogene che di soppressore tumorale, argomento fortemente dibattuto. A conferma di ciò, la localizzazione subcellulare e la funzione di Sirt1 variano nei differenti tipi cellulari (1). E’ anche noto che Sirt1 risulta frequentemente clivata in varie linee cellulari grazie ad attività proteolitiche nucleari (2). Questo studio ha lo scopo di identificare lo stato della proteina Sirt1 in cellule di carcinoma mammario MDA-MB231. I nostri risultati dimostrano che Sirt1 risulta espressa a bassi livelli nella forma “full lenght”, mentre si riscontrano alti livelli di sue forme clivate sia nucleari che citoplasmatiche. Sulla base di analisi bioinformatiche sui possibili siti di clivaggio di Sirt1 (Peptide Cutter Prediction-ExPASy), abbiamo ipotizzato che alcune delle forme di clivaggio da noi osservate, possano essere attribuite all’azione della caspasi-8. Abbiamo evidenziato all’interno del nucleo di cellule MDA-MB231, la forma procaspasica (55 kDa) accompagnata dalla presenza di frammenti attivi (48-18 kDa). Abbiamo, anche evidenziato una ulteriore forma della caspasi-8 a maggior peso molecolare (75 kDa) che, secondo dati bibliografici, potrebbe essere attribuita ad una forma di sumoilazione, da alcuni indicata come segnale di import nucleare (3). Abbiamo pertanto effettuato analisi su immunoprecipitati della caspasi-8 sviluppati contro anticorpo anti-SUMO1, dimostrando che nel nucleo di cellule MDA-MB231, la caspasi-8 è anche in forma sumoilata. Allo scopo di dimostrare che i frammenti di Sirt1 da noi osservati, sono effettivamente frutto dell’azione della caspasi-8, abbiamo trattato le cellule MDA-MB231 con un inibitore generico delle caspasi (Z-VAD-FMK). I risultati dimostrano il decremento nella frazione nucleare dei livelli di una delle forme di clivaggio di Sirt1, un frammento c-terminale di 65 kDa (p65-Sirt1). Dati preliminari sembrano indicare che il frammento p65-Sirt1 possa essere esportato nel citosol. In cellule MDA-MB231 trattate con Leptomicina B (inibitore dell’export nucleare), analisi di immunofluorescenza e analisi di western blotting effettuate su frazioni citosolico-nucleari, hanno evidenziato che il frammento p65-Sirt1 decrementa nella frazione citosolica e si accumula nel nucleo. E’ stato suggerito che frammenti della proteina Sirt1 possano sequestrare il citocromo c svolgendo così un ruolo anti-apoptotico (2). Nostri studi futuri avranno l’obiettivo di verificare tale aspetto.

UR - http://hdl.handle.net/10447/88505

M3 - Paper

ER -