Valutazione della contaminazione batterica dei formulati in polvere per lattanti: caratterizzazione biomolecolare di enterobatteri appartenenti alle classi di rischio A e B.

Progetto: Research project

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Il latte formulato in polvere per l’alimentazione dei lattanti è un prodotto non sterile che può essere contaminato già in fase di produzione da germi, in particolare da batteri di origine ambientale e, una volta reidratato, rappresenta un buon terreno di crescita per molti microrganismi. Numerosi sono i microrganismi finora isolati nei formulati in polvere per l’infanzia ma i più temuti sono sicuramente le Salmonelle, responsabili di entriti e malattie sistemiche, e l’Enterobacter sakazakii, patogeno emergente strettamente associato col latte in polvere e responsabile di gravi patologie nei neonati quali: enterocoliti necrotizzanti, sepsi e meningiti. Questi due microrganismi sono stati inclusi dalla FAO e dall'OMS nella cosiddetta categoria di rischio "A", in quanto sicuramente associati con patologie nei lattanti. Tuttavia, nei formulati in polvere per l’infanzia è possibile ritrovare anche altri microrganismi pericolosi per i neonati quali, E. cloacae, E. aerogenes, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Raoultella ornithinolytica, Escherichia coli, che sono stati associati a enterocoliti necrotizzanti e Pantoea agglomerans, Citrobacter spp ed E. hermanii che possono causare infezioni nosocomiali. Per questo motivo l'intera famiglia delle Enterobacteriaceae è stata inclusa in una categoria di rischio “B” che raggruppa quei microrganismi per i quali la contaminazione del latte in polvere non è stata ancora dimostrata essere la causa delle infezioni neonatali. Questa indagine si prefigge come obiettivo la valutazione della qualità igienica dell’alimento “latte in polvere” attraverso la ricerca e l’identificazione di tutti i microrganismi appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae inclusi nelle categorie di rischio “A” e “B”. La metodica di analisi per la ricerca dei batteri in esame si avvarrà inizialmente di metodi colturali tradizionali standardizzati che permettono determinare la carica microbica nei campioni di alimento per una valutazione del rischio correlato al suo utilizzo. Considerando però i limiti presentati dai classici metodi di identificazione basati su un ridotto numero di caratteri fenotipici, si utilizzeranno anche metodi di identificazione più moderni e precisi, come i micro-metodi miniaturizzati automatizzati e semi-automatizzati e l’analisi genomica basata sulla PCR e sul sequenziamento genico, che permetterà di valutare l’affidabilità delle identificazioni fenotipiche. Saranno, infine, verificate le possibili correlazione tra dati rilevati attraverso le indagini microbiologiche sugli alimenti in polvere per neonati e dati clinici che verranno evidenziati attraverso analisi microbiologiche su campioni di feci e tamponi rettali prelevati da neonati con evidenza di malattia da patogeni intestinali. La tipizzazione genetica degli isolati clinici ed alimentari, effettuata mediante tecniche PFGE e RFLP, permetterà di evidenziare eventuali correlazioni epidemiologiche e di rintracciare le sorgenti di infezione.

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Obiettivi Alla luce delle attuali conoscenze sul ruolo delle Enterobacteriaceae quali responsabili di patologie anche molto severe nei neonati, lo scopo di questo progetto di ricerca è di verificare la presenza di tali batteri in campioni di alimenti in polvere per lattanti prelevati sia direttamente dal commercio che presso i reparti di neonatologia e di pediatria di ospedali siciliani. L’indagine sarà estesa alla ricerca di tutte le specie di Enterobacteriaceae con particolare attenzione per E. sakazakii e Salmonella nei campioni di alimenti in polvere destinati all’alimentazione dei neonati ricoverati e non, al fine di effettuare una valutazione sulla qualità igienica dell’alimento e dei potenziali rischi sulla salute dei consumatori utilizzando una tecnica di isolamento colturale standardizzata (FDA). L’identificare della specie di appartenenza dei microrganismi isolati sarà effettuata mediante i classici metodi fenotipici, ma verrà anche affiancata da test biochimici miniaturizzati (API 20E) e automatizzati (sistema Biolog). Verrà inoltre valutata l’utilità di metodi genetici per la conferma dell’identificazione fenotipica degli isolati appartenenti alle categorie di rischio “A” e “B”, ed in particolare si utilizzerà l’amplificazione “specie-specifica” mediante PCR della sequenza del gene codificante per l’enzima 1,6-a-glucosidasi allo scopo di identificare e/o confermare la presenza di E. sakazakii tra i ceppi isolati e l’amplificazione mediante PCR del gene “universale“ 16S rDNA e suo successivo sequenziamento per identificare e studiare le sequenze nucleotidiche del gene al fine di fornire una identità di specie a tutti i ceppi batterici in esame. La valutazione quantitativa dei microrganismi identificati dai metodi biochimici e di analisi genetica, sarà ottenuta seguendo il metodo per il calcolo dell’ MPN (Most Probable Number), proposto dalla FDA. Si cercherà, inoltre, di individuare possibili comportamenti a rischio da parte di coloro (personale sanitario, genitori) che si occupano della preparazione e somministrazione di tali alimenti, e di individuare misure preventive da adottare a cura del personale sanitario e dei genitori allo scopo di eliminare o almeno minimizzare il rischio di infezioni veicolate con gli alimenti ricostituiti. Saranno, infine, verificate le possibili correlazione tra dati rilevati attraverso le indagini microbiologiche sugli alimenti in polvere per neonati e dati clinici che verranno evidenziati attraverso analisi microbiologiche su campioni di feci e tamponi rettali prelevati da neonati con evidenza di malattia da patologie gastrointestinali. La genotipizzazione dei ceppi isolati permetterà di effettuare eventuali correlazioni epidemiologiche e di rintracciare le sorgenti di infezione. Le correlazioni fra isolati clinici ed alimentari verranno effettuata in base ai risultati delle tecniche di tipizzazione biomolecolare come la PFGE e l’RFLP. Metodi Campioni di latte in polvere e di preparati formulati in polvere per l'infanzia prodotti da ditte diverse e rappresentativi delle marche e delle tipologie di prodotto maggiormente utilizzate in Italia per l'alimentazione dei neonati saranno raccolti sia dalla vendita al dettaglio che dai reparti di neonatologia di diversi ospedali della nostra provincia. La ricerca delle Enterobacteriaceae rientranti nelle categorie di rischio “A” e “B” sarà condotta su questi prodotti secondo il metodo FDA. Per ogni campione saranno prelevate in triplicato tre aliquote da 100, 10 e 1 gr di polvere che verranno reidratate in acqua distillata sterile e sottoposte ad una fase di prearricchimento mediante incubazione a 36°C overnight. Dopo l’incubazione, 10 ml di campione reidratato saranno trasferiti in 90 ml di Enterobacteriaceae enrichment broth (EE broth) e sottoposti ad una ulteriore incubazione a 36°C overnight (fase di arricchimento selettivo). Al ter
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/07 → …

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