Tipizzazione molecolare di stipiti di Listeria monocytogenes isolati in Italia da fonte umana, alimentare ed animale. Valutazione e confronto di tecniche di tipizzazione, elaborazione ed applicazione di protocolli standardizzati: Pulsed Field Gel Electrop

L'Unità di ricerca sarà impegnata, in collaborazione con le altre Unità, sia nella raccolta di stipiti da fonte umana e alimentare che nello sviluppo, applicazione e valutazione comparativa di tecniche di tipizzazione molecolare su stipiti di Listeria monocytogenes isolati da fonte umana ed alimentare. L'attività dell'Unità di ricerca è finalizzata, in particolare, alla standardizzazione, applicazione e valutazione di metodi di tipizzazione molecolare di L. monocytogenes, in particolare dell'elettroforesi pulsata del DNA genomico e di tecniche PCR-basate. Delle due sedi coinvolte, il gruppo di ricerca con sede a Palermo si propone di applicare l'elettroforesi pulsata secondo il protocollo standardizzato utilizzato dai laboratori afferenti alla rete USA "PulseNet", sia nella versione tradizionale di riferimento "multiple-day", che nella versione rapida (Int J Food Microbiol 2001; 65: 55-62) e la procedura di Multilocus Sequence Typing (MLST)su un campione rappresentativo di stipiti. Quest'ultima, pur essendo una metodica più lunga e complessa, dal momento che prevede il sequenziamento dei prodotti di amplificazione, è stata di recente applicata sia a scopo filogenetico che epidemiologico su L. monocytogenes, mostrando un potere discriminativo molto elevato anche rispetto alla PFGE. Essa offre il grande vantaggio che i dati di sequenza sono robusti e i profili allelici ottenuti possono facilmente essere confrontati anche via Internet, sia nell'ambito di un una rete di sorveglianza nazionale, che contro grandi database centrali già esistenti (PubMLST), diversamente dalla maggior parte delle procedure di tipizzazione molecolare che prevedono il confronto di pattern elettroforetici su gel. L'attività del gruppo con sede a Firenze sarà finalizzata, invece, alla standardizzazione, applicazione e valutazione di tecniche di tipizzazione PCR-basate "real-time", con particolare riferimento a RAPD, PCR-RFLP, rep-PCR. Si tratta di tecniche, che pur condividendo semplicità e rapidità di esecuzione, hanno proprietà analitiche, rapporto costo-vantaggio e opportunità di applicazione diverse: la RAPD (random amplification of polymorphic DNA) ha un elevato potere discriminativo, ma presenta peculiari problematiche di riproducibilità intra- e inter-laboratorio e, quindi, presuppone un'accurata standardizzazione metodologica; la PCR-RFLP dei geni di virulenza actA e hly si è dimostrata affidabile e riproducibile e particolarmente efficace nel discriminare le differenti linee clonali di sierotipo 4b; la rep-PCR, termine generico con cui si indica la tipizzazione con primers universali basati su brevi sequenze ripetitive (REP, repetitive extragenic palindromes; ERIC, enterobacterial repetitive intergenic consensus) ha mostrato potenzialità notevoli come strumento di screening, classificando in modo rapido e affidabile in cluster stipiti di L. monocytogenes da fonti umana, alimentare ed animale. Gli obiettivi specifici sono i seguenti: a) sviluppo di procedure di laboratorio standardizzate per l'esecuzione delle tecniche suddette; b) valutazione delle caratteristiche del metodo di tipizzazione; c) creazione di un database di profili elettroforetici; d) stesura di protocolli standardizzati; e) elaborazione di linee-guida per l'interpretazione dei risultati; f) elaborazione di linee-guida per l'integrazione dei metodi di tipizzazione molecolare nelle indagini epidemiologiche su scoppi epidemici.