Tipizzazione di ceppi di Salmonella Enteritidis mediante single-enzyme AFLP

Progetto: Research project

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Description

Salmonella Enteritidis è uno dei principali sierotipi fra quelli responsabili di salmonellosi nell'uomo e nel pollame, in Italia e nel resto del mondo. Negli ultimi anni l'incidenza delle infezioni nell'uomo è tornata a salire e la rete di sorveglianza europea EnterNet ha documentano che più del 75% dei ceppi di Salmonella isolati dall'uomo ed identificati dai laboratori di riferimento nazionali appartengono al sierotipo Enteritidis. La tipizzazione dei ceppi isolati appartenenti a questo sierotipo, necessaria per lo studio della epidemiologia di queste infezioni, è resa difficile dalla ampia circolazione di un numero limitato di cloni batterici fenotipicamente e geneticamente omogenei. La fago-tipizzazione è il metodo di primo approccio tradizionale per la caratterizzazione a fini epidemiologici dei ceppi di S. Enteritidis, ma può essere effettuata solo presso i laboratori di riferimento nazionali, che possiedono le collezioni di fagi, dipende molto dalle capacità interpretative dell'operatore e permette di discriminare solo pochi tipi fagici (PTs). Per tutte queste ragioni, si è cercato di sostituire la fago-tipizzazione con metodi di tipizzazione basati sull'analisi del DNA come la Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Tuttavia, quest'ultima tecnica è piuttosto complessa tecnicamente e richiede costosi apparecchi dedicati. Questo programma di ricerca si prefige di verificare la possibilità di caratterizzare geneticamente S. enteritidis mediante analisi Single-Enzyme Amplified Fragment Length Polymorphism (SE-AFLP), una tecnica rapida e semplice, originariamente messa a punto per la tipizzazione di ceppi di Legionella ed Helicobacter, che non richiede attrezzature sofisticate ed è basata sulla digestione enzimatica del DNA totale batterico e sull'amplificazione selettiva di una parte dei frammenti ottenuti. A tale scopo, la tecnica verrà applicata a isolati umani di S. Enteritidis provenienti da casi sporadici ed epidemici di enterite e ad isolati alimentari e animali già identificati negli anni passati e che saranno raccolti nel corso del prossimo anno al Centro per gli Enterobatteri Patogeni dell'Italia Meridionale (CEPIM) di Palermo e al Centro di Riferimento Nazionale dell'Istituto Superiore di Sanità (ISS) a Roma. Tutti i ceppi utilizzati per questo studio saranno anche caratterizzati mediante fago-tipizzazione e PFGE fingerprinting, in modo tale da poter mettere a confronto la capacità discriminativa dei tre metodi.

Layman's description

Obiettivi Questo programma di ricerca si prefige di verificare la possibilità di caratterizzare geneticamente S. enteritidis mediante analisi Single-Enzyme Amplified Fragment Length Polymorphism (SE-AFLP), una tecnica rapida e semplice, originariamente messa a punto per la tipizzazione di ceppi di Legionella ed Helicobacter, che non richiede attrezzature sofisticate ed è basata sulla digestione enzimatica del DNA totale batterico e sull'amplificazione selettiva di una parte dei frammenti ottenuti. Tutti i ceppi utilizzati per questo studio saranno anche caratterizzati mediante fago-tipizzazione e PFGE fingerprinting, in modo tale da poter mettere a confronto la capacità discriminativa dei tre metodi. Metodi Nell'ambito delle tecniche di DNA fingerprinting, negli ultimi anni sono andate progressivamente imponendosi metodiche basate sulla polymerase chain reaction (PCR), come l'analisi di random amplified polymorphic DNA (RAPD) o applicazioni ancor più sofisticate come l'amplified fragment length polymorphism analysis (AFLP). Questa tecnica, originariamente messa a punto come metodo universale per la tipizzazione genetica di piante da coltura, è stata poi applicata alla caratterizzazione di DNA animali e di procarioti. Essa si basa sulla digestione enzimatica del DNA totale batterico, seguita da amplificazione selettiva di una parte dei frammenti di DNA mediante l'utilizzo di oligonucleotidi adattatori e susseguente annealing di primer contenenti sequenze complementari agli adattatori ma con un nucleotide addizionale arbitrario all'estremità 3’. In questo progetto di ricerca, una tecnica AFLP basata sull'utilizzo di un solo enzima di restrizione, single enzyme AFLP (SE-AFLP), originariamente messa a punto per la tipizzazione di ceppi di Legionella ed Helicobacter, verrà applicata a isolati umani provenienti da casi sporadici ed epidemici di enterite da S. Enteritidis e ad isolati alimentari e animali apparteneti allo stesso sierotipo identificati negli anni passati e nel corso del prossimo anno al Centro per gli Enterobatteri Patogeni dell'Italia Meridionale (CEPIM) di Palermo e al Centro di Riferimento Nazionale dell'Istituto Superiore di Sanità (ISS) a Roma. Tutti i ceppi utilizzati per questo studio saranno anche caratterizzati mediante fago-tipizzazione e PFGE fingerprinting secondo il metodo di Schwartz e Cantor, in modo tale da poter mettere a confronto la capacità discriminativa dei tre metodi. I profili di restrizione e di restrizione-amplificazione ottenuti, rispettivamente, con la PFGE e con la SE-AFLP verranno analizzati con un software dedicato in grado di standardizzare la taglia dei frammenti ottenuti e di valutare le distanze filogenetiche fra i profili (Taxotron, Institut Pasteur, Paris, France).
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/05 → …

Fingerprint

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