Test di tossicità applicati a organismi marini: individuazione di specie target e marcatori biochimici.

Nel D.Lgs 258/00 riguardante il monitoraggio di acque marino-costiere viene ribadita la necessità di definire metodi per la valutazione degli effetti provocati da sostanze chimiche pericolose, persistenti e bioaccumulabili, sulle comunità biotiche degli ecosistemi, ad integrazione dei criteri di determinazione dello stato chimico dei corpi idrici superficiali. Un approccio generale per valutare la tossicità di composti chimici nei sistemi acquatici è basato sui test di tossicità condotti su vertebrati e invertebrati marini, che trovano largo impiego in studi di ecotossicologia e biochimica marina. Malgrado i sistemi in vitro stiano ricevendo da parte della comunità scientifica un’attenzione via via crescente, la legislazione nazionale e comunitaria e i protocolli scientifici richiedono sempre attestazioni in vivo per avere un’evidenza definitiva degli effetti che i composti chimici hanno nei confronti degli organismi marini. Scopo del presente progetto è l’individuazione di organismi marini marino-costiere (vertebrati e invertebrati) da proporre come specie target in test di tossicità (acuta e cronica), allo scopo di mettere a punto dei protocolli utili alla valutazione del rischio da inquinamento da parte di sostanze chimiche prioritarie e non prioritarie. Stadi larvali e giovanili di specie ittiche mediterranee e di invertebrati marini verranno opportunamente selezionati per l’esposizione a breve e lungo termine a composti chimici di differente grado di pericolosità rinvenuti sia nelle matrici acquose che nel sedimento marino.Oltre agli effetti sulla vitalità, nei vari organi e tessuti verranno studiati alcuni indicatori biochimici coinvolti nella risposta allo stress da xenobiotici (metallotioneine MTs, heat shock proteins Hsp), nello stress ossidativo (malondialdeide MDA, idrossinonenale HNE, acidi grassi polinsaturi PUFA), nell’apoptosi (p53, proteine della famiglia bcl2, caspasi, PARP, etc.). I risultati ottenuti potranno contribuire alla individuazione delle concentrazioni minime in grado di determinare nei vari organismi un effetto a livello molecolare, e delle concentrazioni in grado di determinare effetti visibili sulla vitalità, allo scopo di fornire protocolli utili nella definizione di linee guida per la difesa dell’ambiente marino.

I test di tossicità sono procedure analitiche di laboratorio in cui organismi viventi vengono esposti ad una matrice ambientale o ad un agente chimico, in condizioni controllate e standardizzate, per valutare i suoi effetti in vivo. E’ sempre più evidente che l’effetto di sostanze potenzialmente tossiche o inquinanti, contenute nella matrice acquosa o nel sedimento marino va verificato in modelli sperimentali compatibili con le specie autoctone appartenenti a diversi gruppi tassonomici, attraverso saggi biologici a breve o lungo termine. Tuttavia la legge in vigore non specifica, per le acque marino-costiere, le specie bersaglio da utilizzare nei test, a differenza di quanto avviene per le acque dolci. Il nostro gruppo di ricerca è dotato di sistemi e mezzi per il mantenimento e la stabulazione in regime controllato di organismi marini, sui quali da diversi anni studiamo alcuni indicatori biochimici correlati al metabolismo lipidico e in particolare alle variazioni del profilo dei PUFA nei pesci in relazione a fattori intrinseci ed estrinseci. E’ noto che i PUFA, particolarmente elevati nei tessuti dei pesci, controllano e regolano nei pesci la risposta allo stress, anche da inquinanti, possono determinare stress ossidativo, contribuendo alla produzione di MDA, possono promuovere l’apoptosi. Le correlazioni esistenti tra PUFA, stress ossidativo e apoptosi, ci hanno indotto a proporre uno studio in cui (sulla base dell’esperienza consolidata nel mantenimento di vari organismi marini, nel coinvolgimento dei PUFA sul benessere animale, e sui meccanismi molecolari dell’apoptosi) si possa verificare la possibilità di utilizzare stadi larvali e giovanili di specie ittiche mediterranee e altri organismi marini come modello sperimentale in test di tossicità per verificare gli effetti a breve, medio e lungo termine di composti chimici di vario livello di pericolosità. Oltre all’attestazione della validità delle specie studiate come possibili specie target in test di tossicità, lo studio si propone l’individuazione di alcuni markers molecolari correlati all’apoptosi e allo stress ossidativo, che è noto si possono attuare in risposta alla presenza di xenobiotici ancor prima che questi raggiungano nel biota livelli di pericolosità, allo scopo di approfondire i complessi meccanismi d’azione coinvolti nell’uptake, nel metabolismo e nell’eventuale allontanamento degli stessi dall’organismo e contribuire a definire i livelli di pericolosità. Larve e giovanili di organismi animali (Mytilus edulis, Artemia salina, Aphanius fasciatus etc.) verranno mantenuti in acquari con acqua di mare provvisti di sistemi per il controllo di temperatura, salinità, ossigeno disciolto, pH e ammoniaca. Per l’alimentazione verranno utilizzate diete standard correntemente impiegate in acquacoltura. Per test su altri organismi marini di dimensioni inferiori potranno essere utilizzate multiwell da 24, 12 o 6 pozzetti.Dopo aver proceduto con la selezione della sostanza chimica da testare (ad esempio cadmio, TBT etc.), si procederà col test di tossicità a breve (24-48 ore) e a lungo termine. I range di concentrazione prevederanno un ampio intervallo di diluizioni. Quindi si procederà alla somministrazione (acqua, alimento, iniezione). Nel caso in cui la somministrazione avvenga con l’ausilio di un veicolo, saranno predisposti lotti di controllo trattati con il veicolo utilizzato.Ad intervalli regolari di tempo verrà verificata la sopravvivenza attraverso la conta degli individui morti per calcolare il valore di LC50. La riproducibilità statistica del test ne confermerà la sua validità e potrà suggerire se il modello sperimentale studiato potrà essere considerato valido come target per il test di tossicità. Per il monitoraggio di biomarkers utili a valutare l’effetto subletale delle sostanze chimiche testate sullo stress ossidativo e l’apoptosi, campioni di larve e giova