Terapia innovativa della Ipercolesterolemia Familiare basata sulla inattivazione del gene PCSK9

Col presente progetto ci proponiamo di produrre un peptide corrispondente al dominio EGF-A del recettore per le LDL (LDL-R) mediante tecnologia ricombinante al fine di sviluppare una strategia terapeutica innovativa in grado di ridurre i livelli di LDL-colesterolo (LDL-C) in pazienti affetti da severa ipercolesterolemia familiare (FH). Tale strategia si basa sulla inattivazione della proteina PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) da parte di un peptide sintetico o ricombinante che contiene la sequenza aminoacidica del dominio EGF-A del recettore per le LDL (LDL-R). Il peptide EGF-A legandosi a PCSK9 impedirà a questa proteina di interagire con LDL-R, che quindi non verrà degradato. L’effetto netto sarà un aumento del numero di LDL-R sulle membrane cellulari, con conseguente riduzione dei livelli di colesterolo plasmatici. I pazienti che potranno beneficiare di tale strategia sono gli FH omozigoti con un’attività residua del LDL-R, per i quali la terapia standard (LDL-aferesi e statine) non è sufficiente a far raggiungere i livelli raccomandati di LDL-C, nonchè gli FH eterozigoti che rispondono poco all’attuale terapia farmacologica e che pertanto rimangono ad elevato rischio di malattia cardiovascolare. Il progetto è disegnato per stabilire se un peptide EGF-A (prodotto mediante tecnologia ricombinante) sia in grado di legare il PCSK9 secreto. L’obiettivo dovrà essere la dimostrazione dell’esistenza di una interazione tra la proteina ricombinante PCSK9 (recPCSK9) ed un peptide EGF-A ricombinante (recEGF-A). Le proteine ricombinanti saranno sintetizzate sia in batteri che in cellule eucariotiche. Per lo studio delle interazioni sarà utilizzata inizialmente la proteina ricombinante recPCSK9 prodotta in batteri. Poiché il folding di una proteina ricombinante prodotta in cellule procariotiche può talvolta risultare in una proteina funzionalmente inattiva, verranno prodotte proteine ricombinanti anche in cellule eucariotiche (HEK-293). Le interazioni tra recPCSK9 con recEGF-A verrà valutata in vitro mediante esperimenti di co-immunoprecipitazione, western blot e saggi di binding in fase solida. I risultati di questi esperimenti sono preliminare all’esecuzione di studi “in vitro”(oggetto questi di un progetto innovativo di Ateneo) disegnati per valutare la riduzione della degradazione del LDL-R dopo aggiunta di peptide EGF-A a cellule in coltura che esprimono PCSK9 (HepG2 e HEK-293) e a fibroblasti di pazienti con FH-1 omozigote con attività residua del LDL-R.

Obiettivi Il progetto di ricerca è finalizzato allo sviluppo di una nuova strategia terapeutica per ridurre i livelli di LDL-C nei pazienti affetti da forme severe di Ipercolesterolemia Familiare. L’approccio proposto è basato sull'inattivazione della forma secreta della proteina PCSK9 utilizzando un peptide che contiene la sequenza amminoacidica del dominio EGF-A del LDL-R. Gli obiettivi specifici del progetto sono i seguenti: A) dimostrare che un peptide EGF-A ricombinante è in grado di legare la proteina PCSK9 ricombinante prodotta in batteri e in cellule eucariotiche. In particolare valuteremo: 1) quali forme di peptide EGF-A ricombinante e proteina PCSK9 sono più adatti per i successivi esperimenti funzionali; 2) il rapporto molare ottimale per il legame. Metodologie: Per raggiungere gli obiettivi di questo progetto verranno utilizzate le seguenti metodologie: Obiettivo A) 1) espressione della proteina recPCSK9 e peptide recEGF-A in batteri e cellule eucariotiche La regione codificante del cDNA di PCSK9 sarà clonato in un vettore di espressione (pQE Tri-System) ed espresso come recPCSK9 in E. Coli con una His tag all’estremità C-terminale. La proteina sarà purificata tramite cromatografia di affinità e gel filtrazione con una colonna Sephadex G70 in FPLC. Le proteine ricombinanti recPCSK9 e recEGF-A saranno espresse in cellule eucariotiche HEK-293 (FreeStyle- Invitrogen) utilizzando il vettore pCMV SPORT-beta-gal. 3) valutazione dell’interazione tra recPCSK9 con recEGF-A L’interazione tra recPCSK9 con recEGF-A verrà valutata mediante co-immunoprecipitazione. Il peptide sEGF-A sarà marcato mediante biotinilazione con un kit commerciale (Roche). L’immunoprecipitazione verrà eseguita con un anticorpo anti-His. Per la visualizzazione mediante western blot verrà utilizzato un kit streptavidina-POD (Amersham). Il recEGF-A conterrà una tag M2 al C-terminale ed il western blot sarà condotto come descritto usando un anticorpo anti-M2. Un test di conferma dell’eventuale legame sarà eseguito mediante saggi di binding in fase solida facendo interagire i peptidi recEGF-A con recPCSK9 immobilizzato su piastra di polistirene, rivelazione mediante streptavidina POD e lettura su lettore ELISA.