Tecniche di prelievo, isolamento e purificazione di cellule staminali provenienti dal dotto di Wirsung di maiale per la terapia sostitutiva del diabete mellito di tipo I

Progetto: Research project

Dettagli progetto

Description

Il diabete mellito e le sue complicanze sono ancora oggi causa di elevata morbilità e mortalità nel mondo, dal momento che la terapia insulinica non sempre conduce ad un adeguato controllo dell’omeostasi glicemica.Il Trapianto di pancreas pur rappresentando una valida realtà terapeutica è ancora oggi gravato da una serie di problematiche relative non solo alla scarsa disponibilità di organi, ma anche alle complicanze chirurgiche, tra cui il drenaggio della componente esocrina della ghiandola trapiantata altamente litica, che portano al fallimento del trapianto.Anche il trapianto di insule di Langerhans nonostante gli ultimi progressi, presenta diversi ostacoli, quali la scarsa disponibilità di materiale insulare da trapiantare, gli effetti collaterali della terapia immunosoppressiva sui pazienti diabetici, la primaria non-funzione delle insule trapiantate, il rigetto delle insule, la recidiva della malattia diabetica autoimmunitaria.Per tale motivo oggi risulta sempre più importante la ricerca di terapie alternative. Da ciò nasce l’esigenza di esplorare un nuovo campo di sperimentazione che vede l’uso di cellule staminali pluripotenti , le quali hanno insite nella loro espressione genica il potere di rimodellamento e rimarginazione dei tessuti danneggiati che hanno condotto all'evento patologico. Il nostro progetto vuole dimostrare in vitro che anche nei dotti escretori del pancreas sono presenti elementi cellulari pluripotenti partendo dall'assunto che essendo elevato il turn-over dei duttulociti soggetti costantemente all'azione litica della componente esocrina, sarà parallelamente elevata la percentuale di cellule staminali capaci di rinnovare costantemente l'endotelio duttulare. Da ciò risulta estremamente entusiasmante il risvolto clinico, l'idea cioè di poter ottenere cellule Beta-simili dallo stesso paziente diabetico partendo da frustoli bioptici prelevati endoscopicamente dal dotto di wirsung del suo stesso pancreas ormai privo di insule di Langerhans. Tali cellule ottenute ed espanse in vitro protrebbero successivamente essere trapiantate nello stesso paziente diabetico con l'ovvio superamento del rigetto in quanto materiale omologo.

Layman's description

Obiettivi:Gli obiettivi di tale progetto vedono nella fase 1:_ottenimento di cellule staminali provenienti da tessuto duttale pancreatico di maiale dopo microdissezione chirurgica fase 2:coltivazione in vitro e differenziazione delle cellule staminali in cellule beta-simili producenti insulina mediante l'azione di fattori di crescita e di stimoli adeguati (glucosio) Fase 3: verifica della produzione di insulina in vitro mediante immunoistochimica con anticorpi anti-CK 19, anti-insulina, anti-glucagone. Se i risultati laboratoristici confermeranno quanto detto tale protocollo potrà essere applicato su tessuto duttale pancreatico umano. Da ciò risulta estremamente entusiasmante il risvolto clinico l'idea cioè di poter ottenere cellule Beta-simili dallo stesso paziente diabetico partendo da frustoli bioptici prelevati endoscopicamente dal dotto di wirsung del suo stesso pancreas ormai privo di insule di Langerhans. Tali cellule ottenute ed espanse in vitro protrebbero successivamente essere trapiantate nello stesso paziente diabetico con l'ovvio superamento del rigetto in quanto materiale omologo Metodi:Verranno utilizzati pancreas interi da suini adulti prelevati dopo exainguinatio,conservati in "ice storage"in soluzione di Hanks a 4°C supplementata con penn./strept.al 2% e fungizone al 2% per ridurre la contaminazione microbica.Il dotto di Wirsung verrà isolato su banco con tecnica microchirurgica.Il dotto verrà posto in tubo da 50cc.in medium (CMRL,10%FCS,2mM glutamina, 0,1 U/ml insulina umana,2microg/ml dexametasone,2% strept./pen., 2% fungizone)per 2-3 giorni a 37°C al 5% di CO2.Aspirato il surnatante il tessuto verrà lavato 3 volte con medium (DMEM-HEPES,0,1 mg/ml inibitori della tripsina,30mg/ml BSA,2mM glutamina,2%strept./pen.,2% fungizone,NaOH pH 7,4)e poi trasferito nello stesso medium con 1mg/ml di collagenase e digerito per 30’in bagno shaker a 37°C.La digestione verrà bloccata lavando con medium 2 volte a TA dopo centrifugazione per 1’a 2000 rpm e poi con medium una volta a 4°C in ice,si centrifugà per 1’ a 2000 rpm ,si aspirerà il medium e si risospenderà il pellet con medium (145mM NaCl, 4,5 mM KCl,2,0 mM EGTA,5,6 mM glucosio,10mM HEPES,2% strept./pen., 2% fungizone),ed si incuberà per 10’ al 5% di CO2. Si aspirarà il sovranatante e si risospenderà il pellet con medium (CMRL,10% FCS, 2mM glutamina,0,1U/ml di insulina,2microg/ml dexametasone,5,6 mM glucosio,2% strept./pen.,2% fungizone, suppementato con 2mM CaCl2,1mM MgCl2,NaOh pH 7,4)si porrà in flasks non trattate a 37°C al 5% di CO2.Dopo 2 giorni tolto il medium si aggiungerà lo stesso fresco e si incuberà per altri 2 giorni.Alla formazione del monolayer di cellule si cambierà il medium con quello fresco.Dopo 1-2 settimane si aspirerà il medium e si aggiungerà il medium[DMEM-HEPES, 2mM glutamina,1g/ml ITS(insulin-trasferrina-selenio),2g/lBSA,10mM nicotinamide, 10ng/ml KGF).Le cellule verranno cosi coltivate ed espanse per 5-7 settimane cambiando il medium ogni 3 giorni e quindi identificate mediante immunoistochimica ed altre avviate alla differenziazione. Per la differenziazione in cellule beta-simili le flasks verranno subbivise in 4 gruppi :nel primo il medium sarà senza glucosio (controllo),negli altri tre sarà rispettivamente di 5,6mm/L ,18mM/L e 25mM/L.Le cellule del monolayer verranno fissate per 30’ in 40g/L PFA 8PFA,in 0,1mol/l PBS ,ph7,2)e poi lavate in 0,01 mol/L di PBS pH7,2.I campioni verranno poi incubati con 30ml/L acqua ossigenata in metanolo puro per 30’a TA, e poi recuperati per tre volte con forno a microonde a 750V in 0,1 m/l pH 6,0 di tampone citrato ed incubati con 10g/L di BSA con Triton X-100 a 37°C per 30’. L’identificazione delle cellule prevederà l’uso di anticorpi primari per CK19, per insulina e per glucagone ed come secondario anticorpo di rafano trattato con perossidasi e come sistema di rivelazione 1 g/L3’- diaminobenzidina (DAB) in 30 mL/L di acqua ossigenata a TA per 5’,po
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/04 → …

Fingerprint

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