STUDIO GENETICO SUL GENE PCSK9 NELLA IPERCOLESTEROLEMIA AUTOSOMICA DOMINANTE

L’ipercolesterolemia autosomica dominante (ADH) è un disordine a trasmissione autosomica dominante caratterizzato da aumento del colesterolo sierico legato alle lipoproteine a bassa densità (LDL-C). L’ADH è geneticamente eterogenea e può essere causata da mutazioni: i) nel recettore delle LDL (LDL-R) con conseguente ridotta captazione e catabolismo cellulare delle LDL plasmatiche (OMIM 606945) (Ipercolesterolemia Familiare - tipo 1, FH-1); ii) nel gene per l’apolipoproteina B-100 (apoB) con la sintesi di un’apoB-100 difettiva non in grado di legare il LDL-R (ApoB Familiare Difettiva, OMIM 603776, FH tipo 2, FH-2); iii) nel gene del PCSK9 con alterazione della funzione dell’enzima proteolitico PCSK9 (OMIM 603776 , FH-tipo 3, FH-3). FH-1 è un disordine comune che colpisce circa 1/500 individui in eterozigosi. Gli eterozigoti per FH-1 sviluppano xantomi tendinei, arco corneale e malattia coronarica su base aterosclerotica; questa ultima manifestazione clinica di solito diventa evidente nella quarta o quinta decade di vita. Gli omozigoti per FH-1 sviluppano queste caratteristiche con una velocità maggiore. La rara FH-3, la forma di ADH scoperta più di recente, è causata da mutazioni nel gene del PCSK9. Sono disponibili pochi dati su: a) la prevalenza di mutazioni missenso del PCSK9 in probandi/famiglie con ADH in cui è stato escluso il coinvolgimento dell’LDL-R e dell’ApoB; b) l’effetto delle mutazioni missenso del PCSK9 in probandi/famiglie con le forme più comuni di ADH (FH-1, gene per LDL-R). L’obiettivo principale del progetto di ricerca è studiare il ruolo del gene del PCSK9 nella ipercolesterolemia autosomica dominante (ADH) e, in termini più generali, il ruolo sui livelli di colesterolo plasmatici in soggetti con ipercolesterolemia.

Obiettivi L’obiettivo principale del progetto di ricerca è studiare il ruolo del gene del PCSK9 nella ipercolesterolemia autosomica dominante (ADH) e, in termini più generali, il ruolo sui livelli di colesterolo plasmatici in soggetti con ipercolesterolemia. Gli obiettivi specifici sono: Obiettivo 1 Identificazione di mutazioni del gene del PCSK9 con guadagno di funzione in pazienti con diagnosi di ADH non correlata con i geni dell’LDL-recettore e/o dell’apoB. a) risultati preliminari e razionale. In una serie di probandi non consanguinei con ADH abbiamo identificato 20 mutazioni nel gene dell’LDL-R, 15 già descritte e 5 nuove. Due mutazioni, la G528D (FH Palermo-1) e la Y398X, hanno una elevata prevalenza. Nel 20 % di probandi non consanguinei non abbiamo identificato alcuna mutazione patogenetica nei geni per LDL-R e ApoB. b) Ricerca di varianti del PCSK9 in pazienti con ADH non correlata ai geni per LDL-R e/o apo B. Verrà studiato il gene del PCSK9 ai pazienti con ADH della nostra serie con sospetto di FH-3 (vedi sopra). Nel caso di identificazione di una variante non descritta stabiliremo se questa variante: i) co-segrega con il fenotipo ADH nella famiglia; ii) è presente in un gruppo di almeno 100 soggetti normolipemici selezionati in modo casuale, in modo da avere una stima della sua frequenza nella popolazione; ii) è presente in 100 soggetti ipercolesterolemici “controllo” Obiettivo 2 Analisi del gene del PCSK9 in soggetti ipercolesterolemici di una popolazione italiana free living Questo obiettivo si propone di caratterizzare lo spettro delle varianti geniche del PCSK9 e studiare i contributi relativi sulla variabilità dei livelli plasmatici di LDL-C nella nostra popolazione. Studieremo soggetti con livelli di colesterolo plasmatico superiore al 85° percentile provenienti da una popolazione “rurale siciliana “free living”. Di questi soggetti sono disponibili campioni di plasma e DNA così come un database con le caratteristiche demografiche. Quest’analisi ci permetterà di valutare il tipo e la frequenza delle varianti geniche presenti in questi soggetti ipercolesterolemici. Obiettivo 3 Analisi del gene del PCSK9 in probandi e famiglie con FH-1 con mutazioni del gene dell’LDL-R. Come menzionato sopra abbiamo identificato un numero di mutazioni patogenetiche del gene per LDL-R in probandi e famiglie non consanguinee. Considerata la disponibilità di un numero accettabile di soggetti con FH-1 genotipizzati e un ampio numero di portatori delle due mutazioni prevalenti ci proponiamo di studiare l’effetto di varianti geniche del PCSK9. Questo studio condotto in un contesto molecolare ben caratterizzato potrebbe aggiungere nuove informazioni sui fattori genetici responsabili della variabilità sia dei livelli plasmatici di LDL-C che degli effetti clinici in pazienti con FH-1 eterozigote. Metodologie Tests biochimici di laboratorio (colesterolo totale, trigliceridi, colesterolo-HDL, colesterolo-LDL) mediante metodi standard; apoAI, apoB mediante metodi immunonefelometrici. L’analisi dei tre geni (LDL-R, ApoB e PCSK9) responsabili di ADH, nel campione in esame riportato nella descrizione degli Obiettivi, sarà condotta come segue. La strategia di sequenza dei 18 esoni del gene del LDL-R, dei 12 esoni del gene del PCSK9 e della regione di binding allargata del gene dell’apoB (dal nucleotide 9918, codone 3237, al nucleotide 11237 – codone 3676 del gene dell’ apoB), consiste di 36 reazioni di PCR raggruppate in un profilo di amplificazione, seguite da 72 reazioni di sequenza (senso ed antisenso) per ogni soggetto. Nel caso di identificazione di mutazioni nonsenso è ragionevole suggerire un ruolo causale; in caso di mutazioni missenso dobbiamo verificare se la variante trovata rappresenta un polimorfismo comune o una mutazione rara con un effetto biologico. A questo scopo l’analisi di sequenza di queste varianti geniche sarà condotta su un grup