Studio del possibile recettore di membrana della Vasostatina-1 umana, del corrispondente peptide di ratto e del peptide HPNC su colture tridimensionali di miocardiociti di ratto adulto

Progetto: Research project

Dettagli progetto

Description

La CGA ed altre proteine vengono accumulate dalle cellule cromaffini della midollare del surrene all’interno dei granuli secretori con le Catecolamine (CAs). Sotto lo stimolo di particolari segnali, quale l’adrenergico, la CGA ed altre proteine vengono rilasciate con le CAs sia in circolo che nei tessuti, dove vengono convertiti in vari peptidi da convertasi tissutali. Dal taglio di queste proteine ad opera di proteasi tissutali si formano dei peptidi, tra questi le più note sono le due Vasostatine derivate dalla CGA (VSs). Recentemente, è stato dimostrato che anche dalla idrolisi della pro-encefalina-A, contenuta nei medesimi granuli della CGA, derivano peptidi con attività non ben identificata. In particolare dalla porzione N-terminale ne deriva un precursore proteico legante la fosfatidiletanolamina (PEBP), dalla quale a sua volta deriva un peptide di 11aa, il “Peptide Neurostimolante Colinergico Ippocampale” (HCNP). Per studiare a livello subcellulare il segnale indotto sia dalle VSs che dallo HCNP, il nostro gruppo di ricerca utilizzerà un un sistema di colture tridimensionali di miocardiociti di ratto adulto, quanto più possibile simile al tessuto cardiaco. Le cellule muscolari cardiache, i miocardiociti, sono cellule altamente differenziate, immobili che non si dividono. Per le loro caratteristiche è difficile isolarle dal miocardio adulto e anche dopo l’isolamento godono di una breve vita in coltura. Durante gli ultimi anni sono stati fatti molti tentativi per creare sistemi di colture cellulari per lo studio delle interazioni cellula-matrice extracellulare e delle forze di trazione generate dalle proteine di membrana nel “microenvironment” del tessuto cardiaco. L’importanza di questi modelli sperimentali è validata dalle recenti convinzioni che in vivo i miocardiociti aderiscono alla matrice extracellulare per mezzo di complessi d’adesione formati da integrine caderine e sindecani, chiamati costameri. Cellule imbibite nella matrice extracellulare o in gel di collagene sono un’alternativa alle colture in monostrato. In questo tipo di coltura le cellule sono ricoperte da un sottile strato di matrice e possono sviluppare contatti cellula-matrice anche sulla superficie superiore o dorsale. L’introduzione di particolari supporti di plastica hanno permesso di sviluppare sistemi di colture 3D per facilitare lo studio delle interazioni cellula-matrice. Questi supporti ci permettono di introdurre tecniche, come la microscopia elettronica, microscopia confocale ed ingegneria dei tessuti, dove il campione 3D è necessario. La microscopia elettronica a trasmissione eseguita su campioni di colture 3D ci permette di evidenziare mediante l’uso dell’oro colloidale i siti di legame delle molecole alla membrana e di identificare, con gli opportuni anticorpi, quale sia effettivamente il recettore della Vasostatina-1 e del HCNP.

Layman's description

Il presente progetto riguarda l’effetto della Vasostatina 1 (VS-1), peptide derivato dall’idrolisi della Cromogranina A (CgA), sui miocardiociti di ratto adulto. Studi eseguiti da Tota et al. (Tota et al., 2007) suggeriscono un effetto inotropo e lusitropico negativo delle vasostatine e del Peptide Neurostimolante Colinergico Ippocampale sul cuore di ratto. Questi rappresentano i primi studi sull’effetto di queste molecole nel cuore, con il modello delle colture tridimensionali intendiamo simulare il tessuto cardiaco cercando di capire quale sia il target cellulare di molecole che inducono inotropismo negativo, quali peptidi derivati da Cromogranina A (CGA), Vasostatine, ed l’HCNP. L’obiettivo principale sarà quello di immunolocalizzare un possibile recettore di superficie o citoplasmatico sia per le VSs che per lo HCNP. Per quel che riguarda la VS-1 ed il suo recettore, molti esperimenti sebbene ancora preliminari, sono stati eseguiti durante gli ultimi due anni (Di Felice et al., 2006). Esperimenti ripetuti d’immunocitochimica, immunofluorescenza ed analisi al confocale su miocardiociti e fibroblasti cardiaci ottenuti dal medesimo miocardio, hanno rivelato una possibile interazione di questa molecola con proteine transmembrana coinvolte nelle interazioni cellula-ECM. Studi condotti con tecniche di preembedding con molecole marcate con oro e l’uso di diverse matrici come substrati delle colture cellulari, hanno suggerito un possibile coinvolgimento di molecole di adesione alla matrice (Di Felice et al., 2006). Le tecniche di pre-embedding su colture tridimensionali verranno migliorate, sia utilizzando oro colloidale di dimensioni variabili, sia utilizzando diversi peptidi controllo coniugati con oro. Inoltre, al pre-embedding con VSs ed HCNP coniugati con oro sarà associata la tecnica di immunogold per evidenziare contemporaneamente sia le molecole di adesione cellulare che alcune molecole citoplasmatiche coinvolte nella trasduzione del segnale. Sebbene si manifesti con caratteristiche diverse, l’effetto della VS-1 umana ricombiante è stato riscontrato sia su miocardiociti che su fibroblasti cardiaci (Di Felice et al., 2006). Quindi, per validare l’effetto di questi peptidi tutti gli esperimenti verranno condotti in doppio, sia su miocardiciti che su fibroblasti cardiaci. Data la scarsa disponibilità in commercio di anticorpi per immunogold, verranno prodotti e purificati anticorpi. Questa preparazione richiederà sia servizi esterni di ditte specializzate che l’acquisto di tutto il materiale necessario alla purificazione e marcatura con oro degli anticorpi. A tal fine il nostro gruppo utilizzerà nel presente progetto un modello di colture tridimensionali che, come già dimostrato, è simile al tessuto cardiaco, essendo caratterizzato da miocardiociti di ratto adulto che mantengono una buona organizzazione cellulare anche in coltura tridimensionale (Di Felice, 2007; Di Felice 2006).
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/07 → …

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