STUDIO DEI FATTORI COINVOLTI NEL PERCORSO APOPTOTICO INDOTTO DAI CANNABINOIDI IN CELLULE DI EPATOMA UMANO IN COLTURA

Il presente progetto di ricerca si propone di studiare i fattori coinvolti nell’apoptosi indotta da due cannabinoidi (anandamide e WIN55,212-2) in linee cellulari epatiche normali e tumorali. Negli ultimi anni, numerosi studi hanno evidenziato il ruolo svolto dai cannabinoidi nel controllo del destino cellulare; in particolare è stato dimostrato che tali composti inducono arresto del ciclo proliferativo e apoptosi in numerosi modelli sperimentali in vivo e in vitro. Nostri studi precedenti hanno dimostrato che l’anandamide, un endocannabinoide prodotto fisiologicamente da cellule endoteliali, macrofagi e piastrine, è in grado di indurre un chiaro effetto apoptotico nelle cellule Chang liver, una linea di cellule epatiche non tumorali in rapida proliferazione, mentre le cellule di epatoma sembrano essere resistenti all’azione del composto. Differentemente dall’anandamide, il WIN55,212-2, un potente agonista sintetico dei recettori per i cannabinoidi, è molto attivo nelle cellule di epatoma HepG2. In particolare, con il presente progetto ci proponiamo di: - Valutare il coinvolgimento di PPAR-gamma nel meccanismo apoptotico indotto dai cannabinoidi. Questo fattore di trascrizione, oltre ad intervenire nel controllo del metabolismo glucidico e lipidico, nella modulazione dell’adipogenesi e della risposta infiammatoria, quando attivato da specifici ligandi, può avviare il processo di morte cellulare programmata. - Studiare le modifiche indotte da anandamide e WIN55,212-2 sui livelli di numerosi fattori pro- e anti-apoptotici, e l’eventuale coinvolgimento del mitocondrio nel processo apoptotico. - Valutare nel nostro modello sperimentale l’espressione dei sistemi di sopravvivenza. A tal fine ci proponiamo di valutare l’espressione di AKT e del suo stato di fosforilazione, survivina, heat shock proteins (Hsp70, Hsp27). Il progetto si propone inoltre di studiare il quadro di espressione proteica che caratterizza le cellule Chang liver ed HepG2 in condizioni basali e dopo trattamento con i cannabinoidi allo scopo di spiegare il differente effetto indotto dai composti nei due sistemi cellulari. Studiare i meccanismi biochimici che vengono attivati dai diversi cannabinoidi in cellule di origine epatica, tumorali e non, da una parte può contribuire a conoscere le modalità attraverso cui questi composti agiscono, dall’altra può dare un contributo per chiarire le motivazioni del differente comportamento delle cellule epatiche nei confronti dei cannabinoidi.

Nostri studi precedenti hanno evidenziato l’azione apoptotica di cannabinoidi endogeni (anandamide) e sintetici (WIN 55,212-2) in linee cellulari epatiche umane. Il principale obiettivo di questa ricerca riguarda l’identificazione delle molecole chiave responsabili dell’effetto apoptotico dei cannabinoidi da noi studiati. A tal fine intendiamo: - Valutare inizialmente il coinvolgimento di PPAR-gamma, un fattore trascrizionale presente nelle cellule epatiche che, accanto ai noti interventi nel metabolismo, potrebbe svolgere un ruolo chiave nel mediare la morte cellulare indotta dal WIN55,212-2 nelle cellule di epatoma HepG2. Dati preliminari utilizzando l’antagonista di PPAR-gamma GW9662 sembrano indicare che l’inibizione di PPAR-gamma può contrastare l’effetto apoptotico indotto dal WIN 55,212-2. Saranno inoltre valutati i livelli di fattori pro- e anti-apoptotici la cui espressione è regolata dall’attività trascrizionale di PPAR-gamma. - Valutare i livelli di espressione di alcuni fattori di sopravvivenza, quali la survivina, il fattore AKT e il suo stato di fosforilazione, le heat shock proteins HSP70 e HSP27 nelle cellule epatiche normali e tumorali. Tali studi saranno condotti tanto in cellule tenute in condizioni basali di coltura che dopo incubazione in presenza dei cannabinoidi. Inoltre, intendiamo studiare l’effetto indotto dall’aggiunta di wortmannina, un inibitore specifico della PI-3 chinasi, l’enzima responsabile della fosforilazione e attivazione di AKT. - Il progetto si propone, inoltre, di spiegare le basi della differente sensibilità delle cellule Chang liver ed HepG2 nei confronti dell’anandamide e del WIN55,212-2. E’ noto che l’attività dell’anandamide dipende dalla velocità del suo catabolismo ad opera dall’enzima FAAH. Questa idrolasi delle amidi degli acidi grassi è differentemente distribuita nei vari tipi cellulari e la sua attività può fortemente influenzare l’azione dell’endocannabinoide. Per studiare l’eventuale ruolo dell’enzima intendiamo impiegare uno specifico inibitore e valutare l’attività enzimatica nei due sistemi cellulari. - Un altro obiettivo del progetto è la valutazione dell’intero pathway di espressione proteica che differenzia le cellule HepG2 dalle Chang liver e che potrebbe essere alla base della differente risposta indotta dai cannabinoidi. Tali studi saranno condotti nei due modelli sperimentali mediante analisi proteomica. Metodologie Lo studio sarà condotto su linee di cellule di epatoblastoma HepG2 e su cellule epatiche non tumorali immortalizzate Chang liver. Gli studi sugli effetti apoptotici dei cannabinoidi saranno condotti valutando: -la vitalità cellulare mediante saggio MTT; --la morfologia apoptotica mediante microscopia a luce diretta e a fluorescenza dopo colorazione delle colture cellulari con composti che si intercalano al DNA frammentato; ---la percentuale di cellule in apoptosi mediante studi citofluorimetrici dopo colorazione delle cellule con ioduro di propidio. Esperimenti di western blotting saranno condotti per valutare i livelli dei fattori coinvolti nel percorso apoptotico indotto dai composti o i fattori di sopravvivenza espressi dalle cellule. L’utilizzazione di specifici anticorpi che riconoscono le forme fosforilate permetterà di valutare anche lo stato di attivazione. Per studiare il possibile coinvolgimento del fattore trascrizionale PPAR-gamma nel meccanismo apoptotico indotto in cellule di epatoma HepG2 dal WIN 55,212-2 verranno valutati 1)i livelli della proteina e dei fattori pro- ed anti-apoptotici che sono noti essere modulati da PPAR-gamma utilizzando tecniche di western blotting mediante l’impiego di un anticorpo specifico per PPAR-gamma; 2) i livelli del messaggero tramite RT-PCR impiegando oligonucleotidi specifici; 3) l’attività di binding al DNA mediante saggi EMSA impiegando come sonda marcata con 32P la sequenza di riconosci