Sintesi, caratterizzazione, veicolazione ed analisi funzionale di nuovi profarmaci con azione antiepilettica

Progetto: Research project

Dettagli progetto

Description

Il programma di ricerca comprende una prima fase di preparazione dei profarmaci e una fase successiva in cui i profarmaci ottenuti saranno studiati, in modelli in vivo ed in vitro, sia nelle loro proprietà di veicolazione attraverso la BBB che nelle loro proprietà funzionali. Il programma di ricerca sarà così articolato: 1. Sintesi di elevate quantità di Acido Valproico (VPA) coniugato con i seguenti aminoacidi: L-fenilalanina, L-triptofano, L-leucina, L-metionina ed L-istidina; 2. Sintesi degli analoghi profarmaci radioattivi, marcati nel composto attivo (VPA) o nell'aminoacido per lo studio del destino biologico delle molecole. 3. Valutazione della stabilità chimica ed enzimatica dei derivati del VPA nell'ambiente gastrointestinale, plasmatico e cerebrale, mediante incubazione con soluzioni che mimano diversi fluidi corporei o con siero umano fresco, o con estratti di cervello di ratto. Dall’elaborazione dei dati cinetici enzimatici potrà essere determinata la velocità di attivazione del profarmaco nell'ambiente biologico; 4. Saggi di permeazione per valutare la capacità dei coniugati VPA-aminoacido di attraversare diversi tipi di membrane utilizzando: I) Membrane artificiali che simulino le mucose gastrointestinali; II), Membrane naturali, prelevate dal maiale domestico; III) Un modello in vitro di BBB, comprendente neuroni, astrociti e cellule dei capillari cerebrali (BCEC), questo studio prevede anche l'analisi delle modificazioni metaboliche dei profarmaci durante e dopo aver attraversato le cellule endoteliali; IV) Differenti tessuti epiteliali coltivati in un sistema "transwell" al fine di valutare la possibilità di somministrare i profarmaci attraverso vie alternative alla via orale, buccale, nasale o transdermica. 5. Preparazione e caratterizzazione di liposomi di fosfatidilcolina e/o dimiristoil fosfatidilcolina, in presenza o meno di colesterolo, contenenti i derivati di acido valproico. 6. Indagine sui meccanismi molecolari che stanno alla base della formazione e del mantenimento della BBB e sul ruolo dei neuroni e delle cellule gliali in questi processi. Saranno studiati il meccanismo attraverso il quale sono secreti l'FGF-2 (fibroblast growth factor-2) ed il VEGF (vascular endothelial growth factor) ed i possibili effetti di neuroni ed astrociti sull'espressione di specifici trasportatori nelle BCEC, cercando di: I) Chiarire da quali microdomini di membrana traggano origine le strutture membranose identificate e se la stessa popolazione di vescicole possa veicolare più di un fattore; II) Indagare se le vescicole trasportino anche chaperones molecolari, quali Hsp70 ed Hsp40; III) Studiare la sintesi e la localizzazione dell'occludina e di altre proteine a livello delle giunzioni serrate; IV) Analizzare i meccanismi biochimici di ricezione da parte delle BCEC dei segnali prodotti da neuroni e glia; V) Identificare i fattori cellulari capaci di legare specificamente l'mRNA per l'occludina e di sequestrarlo, bloccandone la traduzione; 7. Analisi dei circuiti intracellulari di trasduzione del segnale, attivati nella corteccia temporale e/o nell'ippocampo di ratto dal VPA e da suoi derivati amminoacidici. A questo scopo si analizzerà l'attività DNA-legante del fattore nucleare kB (NF-kB) e lo stato di fosforilazione e la localizzazione subcellulare dell'NF-kB nelle diverse condizioni analizzate. Poiché è stato dimostrato che il VPA ha anche un effetto sui livelli di espressione di alcuni chaperones molecolari, verrà anche analizzata l'espressione di GRP78 e di Hsp70 (un chaperone dello stress). 8. Studio degli effetti dei derivati del VPA su modelli sperimentali di epilessia in vivo e in vitro valutando: I) Le variazioni di alcuni parametri (latenza, e durata) dell’attività parossistica di neuroni del giro dentato in un modello in vivo di epilessia parziale denominato Maximal Dentate Activation; II) Gli effetti dei derivati del VPA in un modello in vitro di epilessia i

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Obiettivi

I farmaci destinati al sistema nervoso centrale (CNS) danno spesso deludenti risultati per la bassa capacità permeante di molte molecole a livello della barriera ematoencefalica (BBB). Per superare questi limiti, è importante capire le basi molecolari del trasporto attraverso la BBB e disegnare farmaci con alta capacità di permeazione attraverso la membrana plasmatica delle cellule dei capillari cerebrali (BCEC). La lipofilicità dei farmaci è stata una strategia ampiamente usata per migliorarne le proprietà di permeazione, ma più recentemente molta attenzione è stata prestata ai sistemi di trasporto presenti nelle BCEC e responsabili sia dell'afflusso che dell’efflusso. Utilizzando l’acido valproico (VPA) come composto modello, il progetto propone la sintesi di derivati amminoacidici del VPA per studiarne le capacità permeanti e gli effetti a livello cellulare e molecolare in modelli sperimentali sia in vivo che in vitro. Il VPA è stato scelto in quanto sebbene ampiamente usato come farmaco anti-epilettico ad ampio spettro, causa nel 70% dei pazienti effetti collaterali indesiderati (1), e sebbene entri facilmente nelle BCEC, la sua distribuzione nel cervello è limitata dall'alto grado di efflusso dal cervello al sangue. Nella prima fase del progetto l’obiettivo è quello di ottenere derivati amminoacidici del VPA che nella forma libera o dopo inclusione in vescicole lipidiche, saranno incubati in soluzioni che mimano la composizione dei fluidi biologici per predirne il destino e la stabilità in circolo. Colture primarie o linee stabilizzate di BCEC, coltivate da sole o in presenza di altre cellule cerebrali, come neuroni e astrociti, saranno utilizzate per stimare la permeabilità della BBB ai derivati amminoacidici del VPA e per predire l'efficienza di afflusso e di efflusso. Sarà analizzata anche la capacità di estratti cerebrali di ratto di metabolizzare il profarmaco, liberando il principio attivo. Una volta determinate le proprietà di permeazione del composto, il passo successivo sarà quello di analizzare i suoi effetti sul SNC con i seguenti obiettivi: a) investigare i circuiti intracellulari noti di trasduzione del segnale, attivati nella corteccia temporale e/o nell'ippocampo di ratto dal VPA e da suoi derivati amminoacidici; b) studiare gli effetti dei derivati del VPA su modelli sperimentali di epilessia in vivo e in vitro valutando le variazione dell'attività elettrofisiologica extracellulare di singole unità neuronali dell'ippocampo; c) analizzare i livelli di espressione di geni influenzati dall’epilessia ed utilizzati come indice di attività del VPA contro l’epilessia. Nell’insieme, il progetto si propone di integrare tipologie di analisi, approcci e modelli sperimentali diversi allo scopo di studiare veicolazione, permeazione, effetti anticonvulsivanti e meccanismi molecolari d'azione di profarmaci amminoacidici diretti al SNC.

1. Bello-Ramirez AM et al., Epilepsia 43, 475 (2002).


Metodologie

Amminoacidi essenziali sono stati recentemente utilizzati per sintetizzare derivati amminoacidici del VPA da un gruppo partecipante al progetto (2). Per la veicolazione in liposomi il profarmaco sarà incluso in vescicole lipidiche con procedure in uso nei laboratori di partecipanti al progetto, che provvederanno anche alla caratterizzazione delle proprietà delle vescicole fosfolipidiche. Per i saggi di permeazione dei derivati del VPA saranno adoperati i seguenti modelli: i) membrane che simulino le mucose gastrointestinale, buccale o nasale, e che separano in una camera di permeazione un compartimento donatore (riempito con succo gastrico, enterico, saliva o secreto nasale) da uno accettore (contenente plasma artificiale); ii) cellule epiteliali, coltivate in un sistema "transwell", dove le cellule si trovano all'interfaccia tra i compartimenti donatore e accettore; iii) un modello in vitro di BBB, comprendente neuroni (nel fondo dei pozzetti transwel
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/07 → …

Fingerprint

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