Sensibilizzazione di cellule tumorali al segnale Trail. Ruolo di NFkB e AKT.

    Progetto: Research project

    Dettagli progetto

    Description

    Trail è un membro della famiglia di ligandi correlati con il TNF. E’ noto che diverse forme tumorali resistenti al Trail diventano sensibili dopo stimolazione con specifici agenti. Nostri studi hanno evidenziato che tanto le cellule di epatoma HepG2 che di carcinoma del colon HT29 sono resistenti al Trail, ma vengono sensibilizzate da dosi limitate di HDACI, in particolare Tricostatina A, ITF2357 e SAHA.
    Il presente progetto si propone di approfondire questi studi e chiarirne gli aspetti molecolari. La ricerca si svilupperà nelle seguenti fasi:
    Valutazione degli effetti citotossici. Saranno condotti studi di vitalità cellulare per individuare efficaci associazioni tra ricombinante Trail e deboli concentrazioni di HDACI. Eventuali effetti sinergici verranno dimostrati mediante la tecnica di Chou e Talalay.
    L’attivazione dell’apoptosi verrà accertata mediante analisi citofluorimetriche con annessina V e analisi morfologiche mediante colorazione con Hoechst 33342.
    Valutazione dell’attivazione dei recettori. Valuteremo mediante analisi di western blotting e real time PCR l’effetto degli HDACI e della combinazione SAHA/TRAIL sull’espressione tanto dei recettori DR4 e DR5 che dei recettori decoy.
    Per valutare se il SAHA favorisce la formazione del complesso TRAIL-DISC tratteremo le cellule dapprima con basse dosi di SAHA e in seguito con TRAIL biotinilato onde indurre la produzione del complesso.
    Valutazione della downregulation di c-FLIP. Valuteremo l’effetto del trattamento combinato SAHA/TRAIL sul livello di cFLIP. Specifici siRNA diretti contro cFLIP saranno impiegati per accertare se la dowregulation di cFLIP è in grado di sensibilizzare le cellule al segnale Trail.
    Ruolo antiapoptotico di NF-kB. Accerteremo gli effetti del trattamento con combinazioni SAHA/Trail sull’attività e sulla composizione di NF-kB, impiegando uno specifico kit Elisa. Poichè NF-kB è responsabile dell’attivazione trascrizionale di geni coinvolti nella sopravvivenza cellulare, valuteremo mediante analisi di western blot e RT-PCR eventuali effetti del trattamento con SAHA, SAHA/Trail, o con partenolide e Bay 11-7085, due specifici inibitori di NF-kB, sull’espressione di Bcl-2, Bcl-XL, A1/Bfl-1, IAPs e c-FLIP, noti targets di NF-KB.
    Ruolo antiapoptotico di Akt. Valuteremo l’effetto di combinazioni SAHA/Trail sul livello di Akt e il suo stato di fosforilazione. Si valuterà anche lo stato di fosforilazione di proteine correlate con l’attività di Akt, quali Bad e caspasi-9. Inoltre, mediante impiego di dominanti negativi per Akt e wortmannina (un inibitore di Akt), verrà accertato se la dowregulation di Akt sia in grado di incrementare la sensibilità delle cellule all’apoptosi.
    Ruolo di NFkB e Akt nella formazione di complessi. Analisi di immunoprecipitazione saranno condotte per valutare se Akt e NFkB possono formare complessi cellulari in grado di esplicare un ruolo attivo nell’inibizione del’apoptosi.

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    Obiettivi
    1.Valutare gli effetti di vari tipi di HDACIs sulla vitalità delle diverse linee tumorali in coltura. Dimostrare, quindi, che concentrazioni sub-tossiche di HDACIs possono sensibilizzare cellule tumorali in coltura a dosi di TRAIL ricombinante prive di effetti citotossici. Confermare, applicando il metodo matematico di Chou e Talalay, che HDACI e TRAIL esplicano un effetto sinergico, come indicato da dati preliminari.
    2.Accertare, mediante opportune tecniche, che l’azione citotossica esplicata da queste combinazioni è determinata dall’induzione di apoptosi.
    3.Dimostrare che dosi limitate di HDACIs sono capaci di sensibilizzare le cellule all’effetto del ricombinante Trail, poiché inducono l’espressione di recettori pro-apoptotici di TRAIL e down-regulation di c-Flip.
    4.Confermare che l’incrementata espressione dei recettori di morte conduce,in presenza di TRAIL, all’attivazione del sistema DISC e della caspasi-8.
    5.Dimostrare che la down-regulation di c-Flip, ottenuta mediante silenziamento, ha un ruolo fondamentale nell’apoptosi indotta dalla combinazione HDACIs/TRAIL.
    6.Verificare che tanto TRAIL che TNF possono stimolare l’attività del fattore di sopravvivenza NF-kB e che questi eventi vengono annullati dal silenziamento di c-Flip.
    7.Dimostrare che NF-kB induce l’espressione di membri anti-apoptotici della famiglia Bcl-2 e delle IAPs, che il trattamento combinato riduce tanto l’attività di NF-kB che i livelli dei suoi targets antiapoptotici e che questi effetti vengono contrastati da inibitori della caspasi-3.
    8.Dimostrare che la chinasi Akt promuove la fosforilazione di Bad e caspasi-9, che il trattamento combinato riduce i livelli di Akt, Bad e caspasi-9 e che questi effetti vengono, infine, contrastati da inibitori della caspasi-3.
    9.Valutare nelle stesse cellule tumorali gli effetti del partenolide, un inibitore di NF-kB, e della wortmannina, composto che inibisce il pathway che porta all’attivazione di Akt.
    10.Verificare la produzione di complessi nucleari tra NF-kB e Akt e dimostrare che la degradazione di uno dei due fattori, indotta dal trattamento combinato, può condizionare la permanenza dell’altro nel nucleo, ostacolando quindi il loro effetto protettivo nei confronti dell’apoptosi.




    Metodologie

    Gli studi saranno condotti su linee cellulari umane di epatoblastoma HepG2 e di adenocarcinoma del colon HT29. Le colture saranno trattate con:
    -TRAIL/Apo2L ricombinante;
    -Inibitori delle deacetilasi istoniche: SAHA, ITF2357 e tricostastina;
    -Inibitori di Akt e di NFkB: rispettivamente wortmannina e partenolide.
    La vitalità cellulare sarà valutata mediante un saggio colorimetrico che impiega lo MTT.
    L’apoptosi verrà valutata mediante citofluorimetria dopo colorazione con Annexina V e ioduro di propidio. L’apoptosi sarà, inoltre, studiata tramite analisi morfologica al microscopio a fluorescenza dopo colorazione con Hoechst 33258.
    L’azione sinergica sarà studiata mediante il modello matematico di Chou e Talalay che permette di calcolare gli indici di combinazione (CI). Valori di CI< 1, uguali a 1 o > 1 indicano rispettivamente un effetto sinergico, additivo o antagonista dei composti utilizzati.
    Analisi di western blot. Estratti proteici (30-50 ug/campione) saranno sottoposti ad elettroforesi su gel di poliacrilammide, trasferimento su filtro di nitrocellulosa e identificazione delle proteine mediante anticorpi specifici. L’analisi densitometrica delle bande sarà effettuata mediante impiego del software IMAGE SXM 1.62.
    Analisi di real time RT-PCR. dei recettori DR4 e DR5. L’RNA totale verrà estratto con il kit RNAeasy (Qiagen) e poi retrotrascritto in cDNA con il kit RT-PCR GeneAmp (Perkin Elmer). L’analisi dei geni sarà condotta con il termocycler IQ5 system (BioRad), impiegando primers specifici e il SYBR green come fluoroforo.
    Studio del DISC. La composizione del DISC
    StatoAttivo
    Data di inizio/fine effettiva1/1/07 → …

    Fingerprint

    Esplora i temi di ricerca toccati da questo progetto. Queste etichette sono generate sulla base dei riconoscimenti/sovvenzioni sottostanti. Insieme formano una fingerprint unica.