Sensibilizzazione al segnale apoptotico Trail determinata da inibitori delle deacetilasi istoniche e da cannabinoidi in cellule tumorali. Possibile nuova strategia nella cura dei tumori

TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)(1), noto anche come Apo-2 ligand, è un membro della famiglia di ligandi correlati con il TNF, che induce apoptosi in cellule che esprimono appropriati recettori associati a membrana, denominati DR4 e DR5. Gli studi sull’apoptosi indotta da TRAIL sono oggi di grande interesse perché le cellule normali appaiono resistenti al segnale TRAIL, mentre molte cellule tumorali possono essere rese particolarmente sensibili a TRAIL mediante impiego di composti di diversa natura. Il nostro programma di ricerca, suggerito dai risultati di esperimenti preliminari, ha come obiettivo quello di sensibilizzare cellule umane di epatocarcinoma, di carcinoma del colon retto e di carcinoma mammario in coltura al segnale TRAIL, associando al “ricombinante solubile TRAIL” sia inibitori delle deacetilasi istoniche (SAHA, ITF2357 e Tricostatina A) che cannabinoidi (WIN e Tetraidrocannabinolo). Per le diverse linee di cellule tumorali in esame ci proponiamo di selezionare dapprima quelle combinazioni di TRAIL con inibitori delle deacetilasi istoniche o cannabinoidi che risultino particolarmente efficaci nell’indurre apoptosi con modalità sinergiche. In seguito con l’intento di accertare il meccanismo mediante il quale il segnale TRAIL può indurre apoptosi intendiamo accertare gli effetti delle più efficaci combinazioni sinergiche sui seguenti aspetti correlati con la morte cellulare programmata: 1. Il ruolo dei recettori per il segnale TRAIL. Verranno studiati i recettori apoptotici TRAIL-R1 e TRAIL-R2 (DR4 e DR5), la cui attivazione consente la produzione del complesso apoptotico DISC, i recettori DcR1 e DcR2, designati come recettori antiapoptotici “decoy”, che antagonizzano il segnale TRAIL, nonché il livello di c-Flip, composto che prevenendo il reclutamento della caspasi-8 da parte del complesso DISC inibisce la trasmissione del segnale di morte. 2. Il ruolo delle proteine della famiglia Bcl-2. Questa famiglia comprende fattori che controllano la morte cellulare programmata, agendo in senso anti-apoptotico o pro-apoptotico. La prevalenza dei membri con funzione apoptotica comporta caduta del potenziale mitocondriale e fuoriuscita dal mitocondrio di alcuni fattori pro-apoptotici, quali il citocromo c. Noi intendiamo accertare modifiche indotte dal trattamento combinato sui livelli delle proteine anti-apoptotiche Bcl-2 e Bcl-XL e delle proteine pro-apoptotiche Bax, Bad, Bim, Bid, Noxa e PUMA, nonchè eventuali modifiche dell’attività trascrizionale dei geni coinvolti. Lo studio sarà completato dalla valutazione del potenziale di membrana mitocondriale. 3. Il ruolo della proteina Akt nella resistenza di cellule tumorali al segnale TRAIL. Akt è un segnale di sopravvivenza cellulare che blocca la via dell’apoptosi, modulando tanto il fattore Bad, un membro della famiglia Bcl-2, che la survivina, un componente della famiglia IAP. Noi intendiamo accertare eventuali effetti indotti dal trattamento combinato su Akt e la sua forma fosforilata, nonché valutare modifiche nell’espressione del messaggero. Infine saranno valutati anche gli effetti determinati dalla wortmannina, composto che impedisce l’attivazione di Akt. In particolare sarà accertato se la wortmannina sensibilizza le cellule tumorali al segnale TRAIL. 4. Il ruolo di NF-kB nella resistenza di cellule tumorali al segnale TRAIL. NF-kB, un importante fattore di sopravvivenza cellulare, può traslocare nel nucleo ed attivare l’espressione di geni target implicati nella protezione della cellula dalla morte per apoptosi, tra i quali i geni che codificano per IAP-1 e IAP-2, Bcl-2 e c-Flip. E’ stato, inoltre, riportato che l’inibizione di NF-kB causa inibizione dell’attività di Yin Yang 1, un fattore che agisce come repressore trascrizionale di DR5. Intendiamo accertare se i trattamenti previsti inducono modifiche nel livello nucleare di NF-kB e delle sue singole componenti, nonché modifiche nel livell

Obiettivi Obiettivo iniziale della nostra ricerca è quello di dimostrare che gli inibitori delle deacetilasi istoniche ed i cannabinoidi sono in grado di sensibilizzare cellule HepG2, HT29 e MDAMB231 all’azione del ricombinante TRAIL. Gli effetti devono essere osservati a concentrazioni che risultino del tutto inefficaci quando i diversi composti vengono impiegati da soli. Si noti che nessun dato è presente nella letteratura scientifica circa l’efficacia del trattamento combinato di HDACI e TRAIL in cellule HT29 e circa la capacità dei cannabinoidi nel sensibilizzare cellule tumorali al ricombinante TRAIL. Obiettivo principale del progetto è quello di accertare le modalità grazie alle quali HDACI e cannabinoidi sensibilizzano le cellule al segnale TRAIL. In particolare riteniamo che HDACI e cannabinoidi possono agire nelle cellule esaminate secondo le seguenti modalità: (1) Induzione dell’espressione di recettori specifici per TRAIL e decremento dell’espressione dei recettori “decoy” e dell’inibitore c-Flip. (2) Contrasto delle specifiche azioni protettive esercitate in queste cellule dai fattori NF-kB e Akt. La dimostrazione di un eventuale ruolo esercitato da NF-kB nella protezione delle cellule dall’apoptosi potrebbe suggerire una possibile combinazione tra HDACI, TRAIL ed inibitori di NF-kB, dotata di elevata capacità nell’indurre l’apoptosi. Questi studi possono condurre alla formulazione di nuove strategie terapeutiche da utilizzare nelle diverse forme tumorali. Metodologie I nostri studi saranno condotti sulle seguenti linee cellulari umane: Cellule di epatoblastoma HepG2 e HuH-6; epatocarcinoma HuH-7; adenocarcinoma del colon HT-29 e carcinoma mammario MDAMB231. Una coltura primaria di epatociti (PHH) e cellule normali del colon CCD-33C verranno impiegati come controllo. L’attivazione della via di TRAIL sarà indotta usando come segnale un composto solubile ottenuto per via ricombinante, comprendente i residui 114-281 di TRAIL, indicato come “ricombinante TRAIL”. Per sensibilizzare le cellule tumorali al ricombinante TRAIL intendiamo impiegare: inibitori delle deacetilasi istoniche (HDACI) quali suberoilanilide dell’acido idrossamico (SAHA), Tricostatina A, ITF 2357, cannabinoidi quali WIN55,212-2, Cannabidiolo e Dexanabinolo. Le linee cellulari saranno coltivate in medium RPMI 1640, addizionato con FCS al 10%, a 37 °C, in un’atmosfera contenente CO2 al 5%. La morfologia apoptotica sarà accertata mediante colorazione con arancio acridina ed etidio bromuro o con annessina V/ioduro di propidio. L’apoptosi sarà quantificata valutando, mediante citofluorimetria, la percentuale di cellule nella fase sub G0/G1. Effetti sinergici tra i composti saranno accertati valutando gli indici di combinazione (CI) secondo il modello matematico di Chou e Talalay. Valori di CI 1 indicano rispettivamente un effetto sinergico, additivo o antagonista dei farmaci utilizzati. Analisi di western blot. Gli estratti proteici saranno sottoposti a separazione elettroforetica su gel di poliacrilammide, trasferimento su filtri di nitrocellulosa ed evidenziazione delle proteine in chemiluminescenza, mediante specifici anticorpi. Analisi di real time RT-PCR. Lo RNA totale verrà estratto mediante il kit RNAeasy (Qiagen) e successivamente retrotrascritto in cDNA usando il kit RT-PCR GeneAmp (Perkin Elmer). I primers per real-time PCR saranno individuati mediante impiego del software Beacon Designer. L’analisi dei geni di interesse sarà condotta con il termocycler IQ5 system (BioRad), impiegando il SYBR green come fluoroforo per accertare il numero di copie di DNA amplificato. Dosaggio di NF-kB. NF-kB sarà valutato in estratti nucleari delle cellule mediante diverse procedure: Kit ELISA che impiega oligonucleotidi contenenti la sequenza consensus per NF-kB; trasfezione con un plasmide che reca copie della sequenz