Selezione e caratterizzazione di geni ed enzimi ecofunzionali da batteri Gram positivi ad alto contenuto in GC per studi ecologici e di biorisanamento

Progetto: Research project

Description

1. Isolamento da suoli contaminati di batteri gram-positivi capaci di degradare miscele di idrocarburi.2. Spettro di utilizzazione degli idrocarburi da parte degli isolati risultati positivi al primo screening3. Costruzione di due genoteche in pESAC di ceppi Gram positivi degradatori di idrocarburi ed identificazione dei cluster catabolici.1. L’isolamento di batteri capaci di degradare miscele di idrocarburi sarà effettuato da campioni di suolo provenienti da un sito contaminato da petrolio, diesel e benzine già individuato. Per l’isolamento saranno utilizzate come fonti di carbonio su mezzo salino delle miscele di petrolio, diesel e benzine allo scopo di offrire la più ampia gamma di molecole disponibili come substrato. Poiché la maggior parte degli idrocarburi è insolubile in acqua saranno utilizzati opportuni solventi, o i composti volatili saranno aggiunti sotto forma di vapore saturo.Saranno effettuati sia isolamenti diretti su mezzo solido sia colture di arricchimento. Risultati preliminari di un primo isolamento già realizzato da questo sito hanno portato all’ottenimento di alcuni ceppi di batteri Gram-positivi che saranno ulteriormente analizzati.2. Gli isolati capaci di crescere sulla miscela di idrocarburi come unica fonte di carbonio e di energia e che risulteranno positivi al test di Gram verranno saggiati per lo spettro di utilizzazione di molecule modello di idrocarburi rappresentative dei diversi gruppi strutturali presenti nel petrolio quali: composti alifatici saturi, cicloalcani, BTEX e poliaromatici. Ogni ceppo sarà saggiato su mezzo salino addizionato con una singola molecola modello o con gruppi di composti simili come unica fonte di carbonio ed energia. Gli isolati positivi verranno inviati alla UR3 per l'identificazione molecolare.3. Due ceppi con spiccate capacità degradative, scelti tra quelli ottenuti dalla nostra UR e/o dalla UR1, e identificati come Gram positivi ad alto contenuto in GC dalla UR3, saranno utilizzati per la costruzione di due genoteche in pESAC. Le genoteche dei due ceppi saranno costruite secondo il metodo utilizzato con successo nel nostro laboratorio per S. coelicolor (Sosio et al., 2000),con opportune modifiche. Il laboratorio è dotato della strumentazione necessaria a realizzare questa fase della ricerca. Il micelio batterico (o le cellule) incluso in cubetti di agarosio, sarà lisato mediante trattamento con lisozima, proteinasi K ed SDS. Il DNA genomico sarà sottoposto a digestione parziale con l’enzima di restrizione Sau3AI, sottoposto a pulsed field gel electrophoresis (PFGE). La frazione di DNA con dimensioni maggiori di 50 kb verrà ligata nel sito BamH1 di pESAC. La miscela di ligazione sarà utilizzata per elettroporare cellule di E. coli. I cloni ricombinanti saranno saggiati mediante PFGE per visualizzare la dimensione dell’inserto. Una genoteca rappresentativa dovrebbe contenere almeno l’equivalente di 5 genomi; con una dimensione media degli inserti di 50 kb sono necessari circa 800 cloni per coprire significativamente un genoma che può raggiungere le 8 Mb del cromosoma lineare di un attinomicete.Lo screening della genoteca in pESAC dei due ceppi selezionati sarà effettuato mediante:a. Colony e Southern hybridisation usando sia sonde eterologhe sia oligonucleotidi specifici ottenuti dalle altre due UR.b. Saggi di attività cataboliche facilmente rilevabili (es. identificazione della catecolo 2,3-diossigenasi mediante spray di catecolo sulla superficie delle piastre dei cloni ricombinanti).Inoltre il DNA dei cloni selezionati sarà utilizzato per trasformare protoplasti di Strepto

Layman's description

Fase 1 ( mesi 1-6, per un totale di 12 mesi/uomo)Isolamento da suolo contaminato di batteri Gram-positivi capaci di degradare miscele di idrocarburiFase 2 ( mesi 3-9 , per un totale10 mesi/uomo)Screening dei ceppi positivi per lo spettro di utilizzazione di molecule modello di idrocarburiFase 3 ( mesi 8-24 per un totale di 30 mesi /uomo)Costruzione di due genoteche in pESAC, identificazione dei cloni che portano cluster catabolici e trasformazione di S. lividansRisultati attesi1.Isolamento di batteri gram-positivi che degradano miscele idrocarburi.2.Costruzione di genoteche di due batteri Gram-positivi ad alto contenuto in GC capaci di degradare miscele idrocarburi3.Identificazione di cluster catabolici degli idrocarburi.4.Espressione eterologa dei cluster catabolici in S. lividans.

Key findings

Ambiente e cambiamento climatico
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/04 → …