Ruolo protettivo di HSP70 e NFkappaB in cellule tumorali in coltura

Progetto: Research project

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Description

Questo progetto di ricerca prevede l’impiego di numerose linee cellulari in coltura, sia normali che tumorali, che verranno esaminate tanto in condizioni basali che dopo il trattamento al calore o con droghe apoptotiche. Tra le proteine da shock termico sarà analizzata in particolar modo la HSP70. Intendiamo accertare i seguenti aspetti: - eventuali variazioni nel livello di questa proteina e del suo messaggero; - il meccanismo molecolare mediante il quale la proteina svolge la sua azione protettiva; - l’eventuale produzione di complessi tra la HSP70 e fattori che intervengono nell’apoptosi, come p53, Bax, AIF e JNK. Per dimostrare l’effettivo ruolo di HSP70 nel contrastare gli eventi di morte, intendiamo ridurre l’espressione di tale fattore mediante siRNA o oligonucleotidi antisenso, o impiego di specifici inibitori. Poiché l’espressione di HSP70 dipende dal fattore di trascrizione HSF1, intendiamo eseguire dei saggi EMSA per valutare l’attività di tale fattore e l’effetto su di esso esplicato da induttori di stress. Il progetto di ricerca si prefigge di studiare anche l’attività di NFkB, un dimero a composizione variabile, costituito dai membri della famiglia Rel. Questo fattore di trascrizione, ubiquitariamente espresso, svolge di norma funzione protettiva assicurando la sopravvivenza delle cellule. Intendiamo accertare mediante saggi EMSA eventuali variazioni di NFkB dopo trattamento con agenti fisici e chimici che possono indurre apoptosi nelle cellule; l’eventuale variazione nella composizione del complesso dopo adeguati trattamenti; eventuali variazioni nei livelli del fattore IkBalfa, proteina che controlla l’attività di NFkB.

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Obiettivi - Individuare i sistemi di difesa che le cellule normali e tumorali attivano in seguito all’induzione di stress, prestando particolare attenzione a HSP70 e a NF-kappaB. - Studiare i meccanismi biochimici attraverso i quali questi fattori proteggono le cellule. - Silenziare questi sistemi per sensibilizzare le cellule tumorali all’apoptosi. - Valutare se questi fattori, in determinate condizioni, possono svolgere una funzione proapoptotica. Metodologie Il progetto si propone di impiegare le seguenti linee cellulari umane: Chang liver (cellule epatiche immortalizzate non tumorali), HepG2 (cellule di epatoblastoma), HuH-6 (cellule di epatocarcinoma), MG63 (cellule di osteosarcoma) e Y79 (cellule di retinoblastoma.). Le cellule saranno esposte per tempi variabili a differenti condizioni di stress quali il trattamento al calore (42-44 °C) o l’incubazione con varie droghe apoptotiche. Gli effetti citotossici indotti saranno studiati sia attraverso la colorazione delle cellule con trypan blue che mediante il test dello MTT. Verranno eseguiti anche saggi citofluorimetrici per discriminare quantitativamente la frazione di cellule vive da quelle con DNA frammentato. Lo studio dell’apoptosi verrà effettuato con l’impiego dell’Annexina V, una proteina che lega la fosfatidilserina, un fosfolipide che trasloca dalla parte interna della membrana a quella esterna nelle fasi iniziali dell’evento apoptotico. In particolare l’impiego di Annexina V-FITC permetterà di evidenziare le cellule in apoptosi precoce e distinguerle da quelle già in tarda apoptosi o in necrosi. Saggi colorimetrici che utilizzano specifici substrati coniugati con paranitroanilina (DEVD-pNA,YVAD-pNA, ecc.) saranno inoltre impiegati per accertare la capacità degli induttori di stress nel promuovere l’attività delle caspasi. Per chiarire il ruolo di HSP70 nella risposta allo stress, l’espressione di questo fattore verrà ridotta trasfettando le cellule con uno specifico siRNA o in alternativa con un oligonucleotide antisenso. La presenza di complessi tra HSP70 e altri fattori coinvolti nell’apoptosi sarà valutata mediante studi di immunoprecipitazione. In particolare, estratti proteici, preparati da cellule trattate e non, saranno incubati con un anticorpo anti-HSP70 e i complessi precipitati tramite beads di sepharose coniugate con proteina A. Le molecole complessate con HSP70 verranno successivamente evidenziate mediante analisi di western blotting. Sempre mediante esperimenti di western blotting desideriamo accertare se l’esposizione a condizioni di stress è in grado di modificare il livello di proteine con attività pro o antiapoptotica. Eventuali variazioni della loro espressione genica verranno valutate mediante RT-PCR semiquantitativa. La capacità di binding al DNA di HSF1 ed NFkB sarà valutata mediante esperimenti di gel shift. A tal proposito gli estratti nucleari di cellule esposte a condizioni di stress saranno incubati in presenza di oligonucleotidi marcati con 32P contenenti la sequenza consensus dei fattori in oggetto. I complessi DNA-proteine saranno sottoposti ad elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti e visualizzati per autoradiografia. La composizione del fattore NFkB sarà studiata nelle varie condizioni sperimentali mediante saggi di supershift che prevedono l’incubazione dell’estratto nucleare con anticorpi specifici diretti contro i possibili componenti del complesso trascrizionale.
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/04 → …

Fingerprint

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