Ruolo neuroprotettivo dei recettori metabotropici per il glutammato di tipo I e II in un modello murino di parkinsonismo e regolazione dell’espressione del GDNF e NGF

1) I recettori metabotropici per il glutammato (mGlu) formano una famiglia di otto sottotipi divisi in tre sottogruppi: gruppo I comprende i recettori mGlu1 e mGlu5; gruppo II, mGlu2 e mGlu3, gruppo III (recettori mGlu4, -6, -7 e -8). Un intricato interplay tra fattori neurotrofici ed il sistema di trasmissione glutammatergico è stato dimostrato sia durante lo sviluppo cerebrale che nel cervello adulto. Infatti, il glutammato può indurre l’espressione di fattori neurotrofici e loro recettori, ed i fattori neurotrofici possono modulare l’espressione di recettori per neurotrasmettitori eccitatori (Lindholm et al, 1994; Mattson, 1996). Questo particolare aspetto è di rilevante importanza poiché i fattori neurotrofici giocano un ruolo chiave nei processi neuroadattativi, che si sviluppano in risposta ad un insulto cerebrale. Un ruolo dei recettori mGlu sia nella neurodegenerazione che nella neuroprotezione è stato già documentato da precedenti lavori (Araki et al, 2001; Battaglia et al, 1998; Battaglia et al, 2002; Bruno et al, 1998a; Bruno et al, 2000a; Bruno et al, 1998b; Kingston et al, 1999; Murray et al, 2002). In alcune delle suddette ricerche è stato anche evidenziato un rapporto tra gli effetti neuroprotettivi dei recettori mGlu e la regolazione del fattore neurotrofico trasforming-growth factor-ß dopo attivazione di recettori mGlu3 largamente espressi sugli astrociti (Bruno et al, 1998c; Ciccarelli et al, 1999). Nell’ambito del progetto di Ateneo 2005 abbiamo evidenziato che il trattamento con DHPG o con LY379268, rispettivamente agonisti dei recettori mGlu del I e II gruppo, determina sia nel ratto che nel topo un significativo incremento del fattore neurotrofico BDNF in specifiche regioni cerebrali quali la corteccia cerebrale e la formazione ippocampale. In relazione ai suddetti risultati con il presente progetto intendiamo estendere lo studio per verificare gli effetti del trattamento con DHPG o con LY379268 sull’espressione di altri fattori neurotrofici quali il “glial derived neurotrophic factor” GDNF ed il “nerve growth factor” NGF. Inoltre, per iniziare a studiare una possibile correlazione tra l’incremento di fattori trofici e la loro azione neuroprotettiva intendiamo valutare gli effetti neuroprotettivi del trattamento con DHPG o con LY379268 in modelli in vivo di neurodegenerazione.

In precedenti ricerche abbiamo evidenziato che il trattamento con DHPG o con LY379268, rispettivamente agonisti dei recettori mGlu del I e II gruppo, determina un significativo incremento del fattore neurotrofico BDNF in specifiche regioni cerebrali quali la corteccia cerebrale e la formazione ippocampale. In relazione ai suddetti risultati con il presente progetto intendiamo estendere lo studio sul ruolo neuroprotettivo dei recettori mGlu I e II con i seguenti obiettivi: 2) Valutare gli effetti del trattamento con DHPG o con LY379268 sull’espressione di altri fattori neurotrofici quali il GDNF ed il NGF; 3) Valutare gli effetti neuroprotettivi del trattamento con DHPG o con LY379268 in modelli in vivo di neurodegenerazione; Ratti e topi adulti saranno trattati, via intraperitoneale (i.p.) o via intracerebroventricolare (i.c.v.)., con diverse dosi di agonisti per il gruppo I e II dei recettori metabotropici per il glutammato o con relativi antagonisti. I ratti saranno trattati con i seguenti composti: 3,5-diidrossifenilglicina (DHPG), agonista dei recettori mGlu1/5, che non essendo biodisponibile centralmente sara' somministrato i.c.v.; MPEP , un antagonista non competitivo dei recettori mGlu5, che sara' somministrato i.p.; LY379268, un potente agonista dei recettori mGlu2/3, che sara' iniettato i.p.; LY341495, un pan antagonista con affinita' preferenziale per i recettori mGlu2/3, che sara' iniettato i.p.. Per le dosi e lo studio dell’andamento temporale della regolazione dell’espressione del GDNF e NGF saranno adoperate le stesse condizioni sperimentali messe a punto nel precedente progetto per la regolazione del BDNF. L’espressione dei fattori neurotrofici sarà esaminata sia a livello di RNAm che di proteina. I livelli di RNAm saranno valutati mediante le metodiche di ibridazione in situ per la localizzazione cellulare e la RT-PCR per la valutazione quantitativa. I livelli di proteina saranno valutati mediante immunoistochimica per la localizzazione cellulare e mediante Western blotting per un esame quantitativo. Per valutare gli effetti neuroprotettivi del trattamento con DHPG o con LY379268 in modelli in vivo di neurodegenerazione sarà adoperato un modello di parkinsonismo. nel topo. A tale scopo i topi saranno trattati con la neurotossina 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) alla dose di 15 mg/kg ripetuta 4 volte ad intervalli di 1,5 h. Questo schema di trattamento con MPTP determina dopo 7 giorni una mortalità del 70% delle cellule dopaminergiche della sostanza nigra, mimando la malattia di Parkinson. Su questo modello sarà verificata l’abilità neuroprotettiva del trattamento con LY379268. Avendo osservato nel precedente progetto di Ateneo incrementi duraturi (da 12h a 18h) del BDNF prodotti da una singola iniezione di LY379268 (250 g/kg), per verificare l’effetto neuroprotettivo del LY379268 sarà scelto un trattamento giornaliero per 6 giorni consecutivi seguito dal sacrificio al settimo giorno. La valutazione della sopravvivenza dei neuroni sarà fatta sia contando le cellule dopaminergiche della sostanza nigra compatta, evidenziate mediante immunoistochimica con specifico marker, sia determinando mediante western blotting i livelli del trasportatore della dopamina ( DAT) nello striato.