Ruolo di proteasi a serina e di metallo proteasi della matrice extracellulare nella dinamica del movimento cellulare

Progetto: Research project

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Description

Una delle condizioni necesarie affinchè una cellula possa muoversi all'interno della matrice extracellulare è che quest'ultima abbia una composizione permissiva. Affinchè ciò avenga le cellule usano esprimere enzimi con attività proteolitica, che possono essere localizzati sulla superficie della cellule oppure essere rilasciati nel mezzo extracellulare; medianti questi "strumenti" le cellule generano un substrato permissivo all'interno del quale possono migrare. In questo studio è nostra intenzione analizzare quali proteasi sono espresse dalle cellule che acquisiscono un fenotipo invasivo, sia esso fisiologico come nel caso del'angiogenesi, che patologico come nel caso di cellule tumorali che acquisiscono la capacità di formare metastasi. Per potere contribuire a spiegare i meccanisni che regolano tale fenomeno svilupperemo tre temi principali di ricerca, e precisamente:

1- Analisi dell'espressione di proteasi di membrana e dei loro mRNA in linee cellulari, tessuti ed organi provenienti da diverse patologie.

2- Ruolo delle interazioni cellula-cellula nel mediare l'espressione di proteasi di membrana in cellule endoteliali.

3- Analisi dell'addensamento ed associazione in complessi proteici sovramolecolari a livello della membrana plasmatica tra enzimi proteolitici e molecole di adesione in cellule endoteliali e/o tumorali, loro ruolo nel guidare l'angiogenesi e/o la formazione di metastasi.

Tra gli obiettivi che si propone ottenere vi è quello di determinare se l'espressione di alcune proteasi e dei messaggeri che le codificano possono essere considerati markers specifici di una condizione cellulare ben precisa. Inoltre se questa condizione è acquisita dalle cellule sotto il controllo specifico da parte di alcune molecole di adesione cellula-cellula e/o molecole delle vie di trasduzione mediate da quest'ultime. In fine, ma non ultimo, si intende verificare se vi è l'associazione ed interazione tra molecole di adesione cellula-substrato e enzimi proteolitici in domini specializzati della membrana plasmatica di cellule in attiva migrazione e come queste interazioni siano implicate nella dinamica del movimento cellulare.

La comprensione dei meccanismi molecolari che regolano i processi mediante i quali le cellule possono muoversi ed invadere un tessuto potrà portare alla generazione di inibitori altamente specifici; come pure alla socperta di marcatori che possano definire una situazione essere fisiologica oppure patologica.

Layman's description

Le proteasi svolgono diverse funzioni come regolatori cellulari. Noi focalizzeremo la nostra attenzione principalmente su alcune proteasi di membrana, precisamente: MT1-MMP, seprase e dipeptidil peptidase 4 (DPP4); ed al ruolo da loro svolto nell'invasione tumorale, nell'angiogenesi e nella formazione di metastasi. Per fare ciò svilupperemo tre temi principali:
1- Analisi dell'espressione di proteasi di membrana e dei loro mRNA in linee cellulari, tessuti ed organi provenienti da diverse patologie.
2- Ruolo delle interazioni cellula-cellula nel mediare l'espressione di proteasi di membrana in cellule endoteliali.
3- Analisi dell'addensamento ed associazione in complessi proteici sovramolecolari a livello della membrana plasmatica tra enzimi proteolitici e molecole di adesione in cellule endoteliali e/o tumorali, loro ruolo nel guidare l'angiogenesi e/o la formazione di metastasi.
Il primo punto è indirizzato a comprendere se l'espressione di diverse proteasi di membrana o dei loro mRNA può essere indice di una potenziale condizione patologica. In questo tipo di studio saranno paragonate tra loro diverse linee cellulari come: MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436, 8701BC (linee cellulari ottenute da un carcinoma della mammella umana con diversa capacità invasiva e di formazione di metastasi); RPMI-7951, SKMEL-28, LOX (le prime due provengono da un melanoma melanolitico umano, mentre le Lox da un melanoma amelanolitico umano); WI38 (sono fibroblasti embrionali umani di polmone); ECV-304 (una linea immortalizzata di cellule endoteliali umane); HT-1080 (una linea proveniente da un fibrosarcoma umano) e HUVEC (cellule endoteliali delle vene del cordone ombelicale umano)che saranno utilizzate come colture primarie. Inoltre saranno usati tessuti ed organi di animali distrofici e non.
Il secondo punto ha lo scopo di comprendere come i contatti cellula-cellula sono implicati nel regolare l'espressione di proteasi a livello della membrana plasmatica. In questo caso gli studi saranno condotti su cellule endoteliali, in quanto un sistema epitelio/mesenchima inducibile sia "in vitro" che "in vivo".
Il terzo punto avrà come fine quello di relazionare se e come enzimi proteolitici e molecole di adesione cellula/matrice si addensano in domini specializzati della membrana, come gli invadoposi e/o le vescicole di membrana. Inoltre se tra queste molecole si costiutiscono dei complessi sovramolecolari e se quest'ultimi sono stabili o dinamici; in altre parole se la dinamica del movimento cellulare prevede l'associazione/dissociazione di enzimi proteolitici e molecole di adesione in momenti diversi del movimento stesso.
Tutti e tre i temi che si intende sviluppare sono tesi a comprendere alcuni dei meccanismi molecolari che sono alla base del movimento cellulare. La loro comprensione potrà essere usata per sviluppare inibitori altamente specifici da utilizzare come modulatori del processo stesso; o come marcatori di una condizione fisiologica o patologica.
Per quanto concerne il primo punto degli obiettivi del progetto si effettueranno esperimenti di immunoblotting e immunofluorescenza sia su cellule che tessuti di animali con patologie specifiche; questo allo scopo di identificare e quantificare la presenza delle molecole in esame. Esperimenti di zimografia e/o di degradazione, su matrici o in soluzione, di substrati specifici si effettueranno per determinare le diverse classi e specie di enzimi proteolitici presenti. Inoltre mediante esperimenti di PCR con trascriptasi inversa e di protezione dei ribonucleotidi si farà un'analisi semiquantitativa degli mRNA presenti nei diversi sistemi sperimentali. Le componenti proteolitiche presenti nelle diverse linee cellulari e/o tessuti saranno analizzate anche in presenza di inibitori specifici ed in presenza di questi sarà saggiata sia la capacità migratoria che invasiva delle cellule trattate e non.



Rigurado al ruolo che le molecole di adesione
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/04 → …

Fingerprint

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