Ruolo di Par-4 nell'attivazione della via apoptotica indotta dal segnale TRAIL

Il prodotto del gene Par-4 è noto svolgere un’azione apoptotica in diversi sistemi cellulari tumorali attraverso l’inibizione dei fattori di sopravvivenza NFkB e Bcl-2. Nostri dati preliminari indicano che l’inibitore delle deacetilasi istoniche SAHA sensibilizza le cellule di epatoma HepG2 all’apoptosi mediata da TRAIL e che questa si accompagna a riduzione dei livelli di Akt ed NFkB. Il nostro programma di ricerca si propone di valutare l’esistenza di complessi nucleari costituiti da Akt, NFkB e Par-4 e di accertare, inoltre, se Par-4 esplica un ruolo nell’apoptosi indotta dal segnale Trail. Al fine di valutare l’esistenza di complessi contenenti Par-4, NFkB e Akt e la loro localizzazione, saranno condotti esperimenti di immunoprecipitazione su estratti citosolici e nucleari di cellule HepG2 in coltura. La produzione dei complessi sarà valutata anche in cellule transfettate con plasmidi dominanti negativi o esprimenti una forma costitutivamente attiva di Akt, nonché in cellule trattate con wortmannina, inibitore di Akt. Inoltre, per valutare il ruolo di NFkB nella formazione dei complessi, saranno eseguiti esperimenti di immunoprecipitazione in cellule trattate con TNFalfa, noto induttore di NFkB, o con partenolide, inibitore di NFkB. E’ noto che l’attività e la localizzazione di Par-4 è modulata dalla fosforilazione su specifici siti. Per valutare se Par-4 è presente nei complessi in uno stato fosforilato, saranno condotti esperimenti di immunoprecipitazione impiegando specifici anticorpi in grado di riconoscere Par-4 fosforilata su Thr163 (sito riconosciuto da PKA o PKC). Al fine di stabilire, inoltre, se Akt è coinvolta nella fosforilazione di Par-4 (su Ser 249), cellule transfettate con plasmidi dominanti negativi o esprimenti una forma costitutivamente attiva di Akt saranno immunoprecipitate mediante anticorpi per Akt e sarà valutata la fosforilazione di GST-PAR4 tramite una reazione chinasica in vitro. Per valutare, infine, se Par-4 esplichi un ruolo nell’apoptosi indotta in cellule HepG2 da combinazioni SAHA/Trail, sarà valutato se il trattamento delle HepG2 con combinazioni di tali fattori modifica la composizione dei complessi costituiti da Par-4, Akt ed NFkB. Saranno, inoltre, condotti esperimenti di western blotting su estratti citosolici e nucleari di cellule trattate con SAHA e Trail, per valutare se l’induzione di apoptosi si accompagna a variazioni della localizzazione e della fosforilazione di Par-4. Plasmidi overesprimenti Par-4 o siRNA per Par-4 saranno anche impiegati per valutare se tale fattore sia in grado di sensibilizzare le cellule al segnale Trail. Infine, poiché dati preliminari indicano che l’apoptosi indotta da combinazioni SAHA/Trail si accompagna ad aumento del recettore DR5 e riduzione di NFkB, sarà valutato se l’overespressione di Par-4 sia in grado di modificare i livelli e/o la localizzazione dei recettori di Trail e il livello di NF-kB.

Il progetto di ricerca si propone di individuare il ruolo esplicato da NFkB e Akt nel controllo dell’attività di Par-4 e di valutare, inoltre, una possibile relazione esistente tra l’attivazione di Par-4 e l’induzione di apoptosi mediata da Trail. Gli obiettivi della presente ricerca possono essere così sintetizzati: 1) Valutare l’interazione tra Par-4, Akt ed NFkB. A tale proposito sarà valutata la presenza di complessi tra Par-4, Akt ed NFkB in estratti nucleari e citosolici di cellule di epatoma umano HepG2 in condizioni basali. 2) Valutare il ruolo di Akt e NFkB nella formazione dei complessi. La composizione dei complessi sarà accertata in cellule transfettate con plasmidi dominanti negativi o esprimenti una forma costitutivamente attiva di Akt. Il ruolo di NFkB sarà, inoltre, valutato mediante impiego di TNFalfa, induttore di NFkB, o di partenolide, inibitore di NF-kB. 3) Valutare se Par-4 è presente nei complessi in uno stato fosforilato e analizzare gli specifici siti di fosforilazione. 4) Dimostrare che Akt interviene nella fosforilazione di Par-4 mediante impiego di dominanti negativi o plasmidi esprimenti una forma costitutivamente attiva di Akt. 5) Valutare se la fosforilazione di Par-4 indotta da Akt si accompagna a variazione nella localizzazione della proteina. 6) Accertare eventuali variazioni nella composizione dei complessi contenenti Par-4 dopo induzione di apoptosi mediata da TRAIL. Poiché è stato precedentemente dimostrato che l’inibitore delle deacetilasi istoniche SAHA sensibilizza le cellule HepG2 all’apoptosi indotta da Trail, sarà valutato l’effetto di combinazioni SAHA/TRAIL sulla composizione dei complessi contenenti Par-4, Akt ed NFkB. 7) Accertare se l’induzione di apoptosi mediata da Trail si accompagna a variazioni nella fosforilazione di Par-4. 8) Accertare il ruolo di Par-4 nella apoptosi mediata da Trail. A tale proposito sarà valutato se l’overespressione di Par-4 o il suo silenziamento sono in grado di modificare l’effetto apoptotico indotto da Trail. Sarà inoltre valutato se l’overespressione di Par-4 determina una variazione del livello e/o della localizzazione dei recettori Trail nonché del livello e dell’attività di NFkB. Metodologie Gli studi saranno condotti sulla linea cellulare di epatoblastoma umano HepG2. Come agenti apoptotici saranno impiegati TRAIL/Apo2L ricombinante e l’inibitore delle deacetilasi istoniche SAHA. Specifici inibitori di Akt (wortmannina) e di NFkB (partenolide) saranno impiegati per valutare il ruolo di questi fattori. La percentuale di cellule in apoptosi sarà determinata mediante citofluorimetria dopo colorazione con Annexina V e ioduro di propidio e analizzando i dati mediante il software EXPO32. Transfezione di Akt. Le cellule saranno transfettate con la forma wild-type (wt), o col dominante negativo (DN) o la forma constitutivamente attiva (CA) di Akt (Upstate Biotechnology). Ogni plasmide sarà transfettato transientemente con Lipofectamina. Preparazione degli estratti citosolici e nucleari. Allo scopo di valutare la localizzazione di PAR-4, i campioni verranno lisati con tampone contenente NP-40 0.5%, il lisato sarà reso omogeneo mediante ripetute aspirazioni con pasteur. Una parte di tale lisato verrà centrifugato a 15.000 g e il sopranatante sarà considerato porzione citosolica. L’altra parte si centrifugherà a 1.300 g e il pellet, risospeso in apposito tampone, riomogenato e centrifugato (1000 g), il pellet così ottenuto sarà considerato porzione nucleare. Analisi di western blot. Estratti proteici (30-50 ug/campione) saranno sottoposti ad elettroforesi su gel di poliacrilammide, trasferiti su filtro di nitrocellulosa e le proteine identificate con anticorpi specifici. L’analisi densitometrica delle bande sarà effettuata con il software IMAGE SXM 1.62. Fosforilazione di PAR-4. La fosforilazione di PAR-4 verrà studiata media