Ruolo di inibitori selettivi dell’istone deacetilasi nella terapia del cancro: studi in vitro dei meccanismi molecolari alla base degli effetti antitumorali di diversi inibitori usati da soli o in combinazione

Gli enzimi della famiglia dell’istone deacetilasi (HDAC) comprendono numerosi componenti distinti in 4 classi e sono tra i principali regolatori dell’espressione genica cellulare. Poichè la trasformazione neoplastica è spesso collegata a mutazioni e traslocazioni cromosomiche con conseguente repressione della trascrizione per un anomalo reclutamento e attivazione dell’istone deacetilasi, gli inibitori di questi enzimi rappresentano possibili agenti terapeutici anticancro. Questi farmaci si legano alle HDAC e inibiscono la loro attività, inducendo acetilazione degli istoni in cellule in coltura con conseguente modulazione dell’espressione di numerosi geni coinvolti nel controllo della crescita cellulare. E’ da notare che la maggior parte dei farmaci finora utilizzati, definiti anche ad ampio spettro, inibisce in modo non selettivo gli enzimi di classe I e II, mentre poco è noto del ruolo delle singole isoforme nella crescita tumorale. Nostri risultati precedenti hanno messo in evidenza che nuove molecole di sintesi con attività inibente l’HDAC non selettiva, quali i derivati dell’acido idrossamico MC1864 e MC1879, erano capaci di indurre effetti antiproliferativi, differenzianti e apoptotici in linee cellulari di leucemia umana in coltura quando impiegati da soli e di sinergizzare con altre molecole ad attività antitumorale come la 3’-metiladenosina in vitro. Il presente progetto sarà rivolto allo studio di inibitori selettivi delle HDAC i cui effetti saranno confrontati con quelli degli inibitori ad ampio spettro. In particolare, si studieranno la loro capacità di indurre apoptosi e le vie biochimiche coinvolte nel processo, impiegando diversi inibitori della via intrinseca ed estrinseca dell’apoptosi, valutando le variazioni nell’espressione di proteine chiave per il processo apoptotico, quali le proteine mitocondriali della famiglia di bcl2, la proteina p53 e le proteine inibitrici dell’apoptosi IAP, misurando il grado di attivazione del mitocondrio e delle varie caspasi e la produzione di ROS. Inoltre, si studieranno gli effetti sul ciclo cellulare, valutando l’influenza dei nuovi composti sulle proteine regolatrici del ciclo quali RB, le cicline, gli enzimi cdk e le proteine inibitrici p21 e p27. Quindi, in una seconda parte dello studio, i nuovi inibitori saranno saggiati in combinazione con altri farmaci antitumorali quali la 3’-metiladenosina che hanno già dimostrato di sinergizzare con gli inibitori non selettivi al fine sia di identificare combinazioni efficaci da usare in clinica sia di elucidare i meccanismi molecolari alla base del sinergismo.

Poiché in precedenti studi è stato evidenziata una significativa attività antiproliferativa e apoptotica da parte degli inibitori non selettivi dell’HDAC, lo scopo della attuale ricerca è quello di studiare gli effetti antitumorali di molecole dotate di attività inibitoria selettiva nei confronti delle isoforme dell’HDAC, quali l’MS275 inibitore della HDAC di classe I, l’MC1575 inibitore della HDAC di classe II e il sirtinolo inibitore della HDAC di classe III con i seguenti obiettivi: 1. Valutare quali tipi di isoenzimi siano coinvolti nei diversi effetti degli inibitori dell’HDAC comprendendo l’effetto antiproliferativo, differenziante, apoptotico e la capacità di sinergizzare con altre molecole come la 3’-metiladenosina e l’imatinib. 2. Identificare i meccanismi molecolari responsabili degli effetti delle varie molecole, studiando in particolare i principali sistemi molecolari preposti al controllo e alla regolazione della proliferazione, della differenziazione e della morte cellulare (il sistema delle cicline, la famiglia bcl2, AIF ecc.). 3. Ricerca di nuove combinazioni efficaci. Verranno studiate combinazioni sia con farmaci antiblastici tradizionali dotati di diversi meccanismi d’azione quali l’inibitore della topoisomerasi II doxorubicina, l’agente alchilante cisplatino, e l’ inibitore del fuso mitotico taxolo, sia combinazioni con nuovi farmaci dotati di meccanismi d’azione alternativi come gli agenti differenzianti retinoidi e l’inibitore del proteasoma bortezomib. In questo studio saranno utilizzate diverse linee cellulari tumorali, le leucemie promielocitiche umane HL60 e NB4, le leucemie mieloidi croniche K562 e KCL22 e la linea di linfoma umano a cellule T HuT78. Tali cellule saranno trattate, inizialmente, in vitro per tempi diversi con concentrazioni crescenti degli inibitori selettivi dell’HDAC impiegati da soli (MS275 inibitore della HDAC di classe I, MC1575 inibitore della HDAC di classe II e sirtinolo inibitore della HDAC di classe III); i risultati saranno confrontati con quelli ottenuti con inibitori non selettivi come la tricostatina A e l’MC1864. Al fine di individuare i meccanismi mediante i quali i composti producono apoptosi, le cellule saranno trattate con gli inibitori dell’HDAC in presenza di diversi inibitori delle vie estrinseca ed intrinseca dell’apoptosi e in particolare con l'anticorpo bloccante il recettore di morte Fas ZB4, con gli inibitori specifici della caspasi 8 (Z-IETD), 9 (Z-LEHD) e 3 (Z-DEVD) e con un inibitore generale delle caspasi Z-VAD. La valutazione dell'eventuale coinvolgimento della via intrinseca sarà realizzata mediante studio dell'alterazione del potenziale di membrana mitocondriale (delta-psi), utilizzando il colorante fluorescente JC-1 e valutando il viraggio di fluorescenza dal rosso al verde dovuto al passaggio del composto dalla forma aggregata a quella monomerica mediante citofluorimetria a flusso. Inoltre verrà valutata in citofluorimetria, prima e dopo trattamento, l’espressione delle diverse proteine coinvolte nel controllo dell’apoptosi e/o del ciclo cellulare quali il recettore di morte Fas, le proteine della famiglia bcl2, p53, RB, le cicline e le cdk, p21 ecc. utilizzando anticorpi monoclonali specifici fluoresceinati. L’influenza dei composti sull’espressione delle proteine IAP sarà studiata mediante western blotting; inoltre la produzione di ROS sarà valutata misurando la riduzione della diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCF-H2) in citofluorimetria. Successivamente e sulla base dei risultati ottenuti le cellule saranno trattate con i composti in studio in combinazione simultanea o sequenziale con quei famaci antitumorali che hanno già mostrato di indurre effetti sinergici con gli inibitori non selettivi e successivamente anche con altre molecole inclusi farmaci tradizionali come la doxorubicina, il cisplatino e il paclitaxel e farmaci cosiddett