Ricerca delle cellule staminali CD133+ nel carcinoma del colon-retto e loro sensibilità ai farmaci antiblastici

Il carcinoma del colon retto è la seconda causa di mortalità per neoplasie. L’isolamento e la descrizione di una nuova linea cellulare nel cancro del colon può determinare una nuova possibilità diagnostica e l’attuazione di modalità terapeutiche sempre più efficaci e selettive. Le cellule cancerogene nel cancro del colon sono incluse nella popolazione ad alta densità CD133+, che rappresenta circa 2.5% delle cellule del tumore. L’iniezione sottocutanea di tali cellule ha riprodotto il tumore originale in topi immunodepressi, mentre le cellule CD133- non hanno formato i tumori. Diversamente delle cellule CD133-, le cellule del cancro del colon CD133+ si sono sviluppate esponenzialmente in vitro per più di un anno come masse indifferenziate del tumore, riproducendo lo stesso modello morfologico ed antigenico del tumore originale. Quindi si può affermare che il cancro del colon retto è generato e propagato da un piccolo numero di cellule cancerogene indifferenziate CD133+, che dovrebbero quindi essere l’obiettivo delle terapie future.

Obiettivo del progetto è quello di prelevare da masse neoplastiche, riscontrate in corso di colonscopia e/o resecati chirurgici, campioni multipli di tessuto neoplastico dai quali isolare le cellule CD133+, piccolissima ma aggressiva e metastatica popolazione di cellule tumorali staminali capaci di determinare, in vivo, neoplasie ancora più aggressive aumentando nel tempo la loro capacità oncogena. Il loro isolamento, la loro coltivazione in vitro e la possibilità di testare la loro sensibilità ai farmaci antiblastici potrebbe aprire nuove frontiere nella prognosi nonché nella sensibilizzazione alla convenzionale chemioterapia di queste cellule tumorigeniche. Le tappe relative alla metodologia della ricerca prevedono: il prelievo di tessuto neoplastico grazie all’esecuzione di multipli prelievi bioptici su tutta la massa neoplastica in corso di colonscopia e/o su resecati chirurgici. Coltura cellulare:i campioni di tumore saranno sottoposti a dissociazione meccanica ed enzimatica. Le cellule tumorali ottenute saranno coltivate in un mezzo “serum-free” addizionato con 20 ng/ml di EGF e 10 ng/ml di FGF-2. Per ottenere le colture cellulari primarie del tumore, dopo dissociazione enzimatica le cellule saranno poste sui capsule ricoperte di collagene in un mezzo DMEM contenente il 10% di FCS. Separazione magnetica e citofluorimetrica delle cellule. Le cellule saranno identificate, per separazione magnetica, 24-48 ore dopo dissociazione enzimatica con “microbeads” CD133/1. Dopo la tipizzazione magnetica o citofluorimetrica, la purezza delle cellule sarà valutata tramite citometria a flusso utilizzando anticorpi anti-CD133/2 (293C3)-ficoeritrina o anti-CD133/2 (293C3)-APC Si procederà quindi alla coltura cellulare in vitro con valutazione delle curve di crescita cellulare. L’immunoistochimica sarà effettuata su frammenti di tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina, su blocchetti di cellule o su tessuto congelato