Resistenza a stress cellulari di cellule staminali e cell signaling

E’ noto che le cellule staminali possono essere recruitate in aree di tessuti danneggiati e in rigenerazione in cui vi sono citochine infiammatorie e cellule citotossiche. Esse devono avere dei sistemi di difesa cellulare per resistere a questi stress. La ricerca era iniziata con lo studio dei meccanismi molecolari mediante i quali le cellule staminali di topo, i mesoangioblasti, cercano di evitare danni (ambientali, infettivi, infiammatori) che altrimenti potrebbero avviarle verso la morte cellulare. Risultati iniziali di questo studio avevano dimostrato che tali cellule staminali sintetizzano in condizioni fisiologiche e di non stress la proteina Hsp70, nota come la proteina di protezione della cellula, generalmente sintetizzata solo durante lo stress cellulare (Geraci F, Turturici G, Galli D, Cossu G, Giudice G, Sconzo G. Cell Death Differ. 2006 13:1057-63). Questa sintesi basale è regolata dal fattore Ku, in cooperazione con altri fattori tipici della trascrizione basale. L’attuale programma di ricerca prevede lo studio del ruolo della proteina Hsp70 nelle cellule A6 in condizioni fisiologiche. Poiché dati preliminari hanno indicato anche la presenza dell’Hsp70 nel mezzo di coltura delle cellule, sarà studiato il meccanismo con cui questa proteina viene rilasciata ed eventualmente sarà avviata una indagine sul suo ruolo extra cellulare. Per quanto riguarda il ruolo intracellulare si silenzierà l’mRNA Hsp70.1/3, procedendo con un silenziamento stabile in modo da ottenere cloni cellulari con una diminuita espressione della proteina Hsp70. Questi cloni verranno analizzati e paragonati alle cellule A6 non silenziate: si valuterà la capacità di resistenza agli stress cellulari. Inoltre si valuterà un eventuale coinvolgimento della proteina Hsp70 nella proliferazione cellulare analizzando i cloni cellulari silenziati e quelli non silenziati. Per studiare le modalità di rilascio saranno condotti esperimenti indirizzati inizialmente ad individuare una eventuale associazione della proteina Hsp70 con la membrana plasmatica in specifici domini di membrana. E successivamente sarà indagato il meccanismo di rilascio: o attraverso microvescicole di membrana o attraverso esosomi. In ogni caso sarà indagato il coinvolgimento del citoscheletro nella vescicolazione, effettuando appropriati esperimenti di perturbazione della struttura citoscheletrica. Questo programma di ricerca è essenzialmente indirizzato ad individuare il / i ruoli della proteina Hsp70. Base di partenza scientifica La proteina Hsp70, generalmente espressa in seguito a stress, svolge in dipendenza della sua localizzazione all’interno della cellula numerose funzioni, anche nei casi in cui è espressa in condizioni fisiologiche. In assenza di stress localizza generalmente nel citoplasma, ma in alcuni casi può trovarsi nel nucleo o a ridosso di questo. Infatti è coinvolta nel mantenimento dell’integrità nucleare (Kurucz, et al. 1999 Cell Stress Chaperones 4: 139-152) ed è correlata al ciclo cellulare (Milarski, et al 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 83: 9517-9521). Diversi studi effettuati sia in vitro che in vivo sostengono l’ipotesi che l’Hsp70 abbia un ruolo essenziale nel mantenimento della stabilità genomica (Kenny, et al. 2001 J. Biol. Chem. 276: 9532-9536). Inoltre è stato riportato (Hunt et al., 2004 Mol Cell Biol 24: 899-911) che topi knockout per i geni hsp70.1/3 (i due geni inducibili in topo), sono più piccoli rispetto ai topi wild-type. Quindi l’inattivazione di entrambi i geni hsp701./3 nei topi influenza la crescita. Le minori dimensioni dei topi hsp70.1/3 knockout potrebbero dipendere dall’aumento del tempo di duplicazione cellulare. Inoltre la linea cellulare MEF ottenuta da questi topi knockout mostra una velocità di proliferazione inferiore, rispetto alla linea wild type (Hunt et al., Mol Cell Biol 2004 24: 899-911). Anche in diverse linee tumorali l’inibizione di Hsp70 porta ad un arresto nella pr

Obiettivi Dati precedenti avevano dimostrato che le cellule staminali A6 sintetizzano in condizioni fisiologiche la proteina Hsp70 (Geraci 2006). L’obiettivo della ricerca è focalizzato sulla comprensione del ruolo della proteina Hsp70 nelle cellule staminali A6 in condizioni fisiologiche. Inoltre, poiché dati preliminari hanno indicato il rilascio di tale proteina all’esterno, l’altro obiettivo è mirato all’analisi dei meccanismi di rilascio dell’Hsp70 e al suo ruolo extracellulare. Per comprendere il ruolo che tale proteina svolge all’interno della cellula sarà effettuato un silenziamento stabile dell’mRNA Hsp70.1/3. I cloni così ottenuti saranno paragonati alle cellule A6 non silenziate, al fine di analizzare le conseguenze che la diminuita espressione della proteina Hsp70 può avere in queste cellule ed individuare così un eventuale suo ruolo. Il secondo obiettivo riguardante il meccanismo di rilascio della proteina Hsp70 nell’ambiente extracellulare sarà raggiunto studiando l’associazione di tale proteina con la membrana plasmatica in specifici domini di membrana. Inoltre lo studio del coinvolgimento del citoscheletro nel processo di vescicolazione, darà indicazioni sul meccanismo di rilascio. Il programma di ricerca ha dunque come obiettivo lo studio del ruolo che la proteina Hsp70 svolge sia all’interno che all’esterno della cellula. Metodologie Per determinare il ruolo della proteina Hsp70 espressa nei mesoangioblasti si silenzierà il suo mRNA sfruttando la metodica dell’RNAi che comporta la degradazione dell’m-RNA target. Si effettuerà un silenziamento a lungo termine mediante plasmidi capaci di integrarsi nel genoma. Questi plasmidi esprimono trascritti di RNA che formano corte strutture a forcina (shRNA). Queste ultime, in seguito, saranno processate da Dicer, una RNasi III citoplasmatica, generando siRNAs che si appaieranno con l’mRNA target e ne indurranno la degradazione. L’effettivo silenziamento dei cloni ottenuti sarà confermato osservando la diminuzione dell’mRNA dell’Hsp70 tramite saggi di RT-PCR semiquantitativa e la diminuzione della quantità della proteina tramite saggi di western blot e successiva analisi densitometrica. Verrà esaminata la capacità di risposta delle cellule silenziate a diversi tipi di stress tra cui stress termico, da cadmio e H2O2, usando kit per la vitalità cellulare (basati sulla misura della quantità di ATP presente nelle cellule) . Si indagherà inoltre se le cellule silenziate saranno più sensibili all’apoptosi rispetto alle cellule non transfettate. A questo scopo verrà valutata tramite luminometria l’attività delle caspasi, le principali molecole coinvolte nel pathway apoptotico. Effettuando saggi citofluorimetrici, si verificherà se le cellule transfettate mostrano una distribuzione delle cellule nelle varie fasi del ciclo cellulare diversa rispetto alle cellule controllo. Allo scopo di valutare il ruolo dell’Hsp70 saranno inoltre eseguiti saggi di proliferazione cellulare con appositi kit (basati sulla misura dell’incorporazione della BrdU durante la sintesi di DNA) e sarà calcolato anche il tempo di duplicazione cellulare dei vari cloni silenziati. Per indagare se l’Hsp70 è associata con la membrana plasmatica, si isoleranno i rafts lipidici sfruttando la loro insolubilità a 4°C con il Triton X-100. Saranno poi separati tramite centrifugazione su gradiente di saccarosio discontinuo. Per verificare se tale proteina viene rilasciata all’esterno della cellula saranno effettuati saggi ELISA sul terreno di coltura condizionato. Inoltre verrà analizzato l’eventuale coinvolgimento del citoscheletro nel meccanismo di rilascio della proteina Hsp70 attraverso l’uso di droghe in grado di alterare la struttura citoscheletrica delle cellule. Le eventuali vescicole deputate al rilascio in ambiente extracellulare dell’Hsp70 verranno isolate attraverso ultracentrifugazione. La caratter