Resistenza a stress cellulari di cellule staminali, differenziate ed embrionali

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La ricerca è iniziata con lo studio dei meccanismi molecolari mediante i quali le cellule sottopoaste a stress di varia natura (ambientali, infettivi, infiammatori) cercano di evitare i danni cellulari che altrimenti potrebbero avviarle verso la morte cellulare. Questo studio è stato affrontato in cellule staminali e cellule differenziate di topo e in un sistema embrionale modello (riccio di mare). E’ noto che le cellule staminali possono essere recruitate in aree di tessuti danneggiati e in rigenerazione in cui vi sono citochine infiammatorie e cellule citotossiche. Esse devono quindi avere dei meccanismi per resistere a questi stress. I risultati di questo studio hanno dimostrato che le cellule staminali mesoangioblasti di topo sintetizzano in condizioni fisiologiche e di non stress la proteina HSP70, nota come la proteina di protezione della cellula e che viene generalmente sintetizzata solo durante lo stress cellulare. Tale sintesi è indipendente dal fattore di trascrizione del suo gene. Inoltre i risultati hanno dimostrato che le le cellule staminali mesoangioblasti di topo rispondono a vari stress cellulari con la sintesi massiva di tale proteina in aggiunta a quella espressa in condizioni basali fisiologiche. Verrà quindi studiato il meccanismo molecolare mediante il quale, in condizione di non stress, viene attivata la trascrizione del gene hsp70. Verrà inoltre studiata la localizzazione subcellulare della proteina al fine di poterne studiare il ruolo. Verranno condotti esperimenti indirizzati ad individuare una sua eventuale associazione con la membrana plasmatica e un suo eventuale rilascio nell’ambiente extracellulare mediante delle vescicole di membrana. Dati recenti di letteratura indicano infatti che la proteina HSP70 può essere rilasciata all’esterno di alcune cellule con ruolo di stimolazione del sistema immunitario e in altri casi con ruolo di molecola segnale per altre cellule che esprimono il recettore di membrana toll-like. Verrà inoltre terminata la ricerca sulla influenza che vari agenti inquinanti, presenti nell’ambiente marino, possono avere sugli embrioni di riccio di mare. E’ noto infatti che gli embrioni di riccio di mare rappresentano un importate anello della catena trofica di ambiente marino e che una perturbazione genica dei primi stadi di sviluppo può avere un enorme impatto sullo sviluppo. Base di partenza scientifica Le cellule rispondono a stimoli ambientali avversi quali: concentrazioni tossiche di metalli pesanti, innalzamento di temperatura, variazione nei livelli di osmoliti, infezioni e malattie, aumentando l’espressione di specifici geni chiamati geni heat shock, la cui espressione gioca un importante ruolo nella protezione cellulare (Lindquist et al., Annu.Rev. Genet. 1998 22: 631-677). Le proteine heat shock sono classificate in differenti famiglie sulla base del loro peso molecolare e la più conservata fra tutte è la proteina HSP70, che infatti può essere usata come marker molecolare di stress (Mukhopadhyay et al., J. Biochem. Mol. Toxicol. 2003 17: 249-254). Le proteine da stress funzionano come chaperone molecolari riparando proteine danneggiate e mantenendole in uno stato di avvolgimento intermedio (Hartl, Nature 1996 381: 571-580). Le HSP70 inducibili dai vari stress sono infatti chiamate anche proteine della vita in quanto rendono le cellule resistenti all’apoptosi e alla azione di sostanze citotossiche. Le cellule staminali devono essere capaci, più di altre cellule, di sopravvivere a vari stress, poiché vengono recruitate in aree di tessuti danneggiati e in rigenerazione, dove citochine infiammatorie e cellule citotossiche possono produrre severi danni cellulari. Le proteine da stress giocano un ruolo nell’adattamento ambientale e questo può essere paticolarmente importante per gli organismi marini che vivono costantemente in ambienti che subiscono cambiamenti. In particolare gli embrioni di riccio di mare sono molto vulner

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Obiettivi L’obiettivo di questa ricerca è di chiarire il ruolo della proteina HSP70 che viene sintetizzata in assenza di stress nelle cellule staminali di topo della linea A6 e di chiarire inizialmente quale fattore sia implicato nella attivazione basale della trascrizione del gene hsp70. Dati ottenuti in precedenza, mediante l’espressione episomale di un gene reporter, hanno indicato che alcuni fattori di trascrizione possono contribuire all’espresione basale del gene Hsp70. Per determinare quale fattore sia critico per la trascrizione basale, si intende procedere “in vivo” nelle cellule con una mappatura della cromatina, per individuare i fattori di trascrizione leganti il promotore del gene Hsp70. Ciò al fine di determinare quali fattori di trascrizione genica sono attivamente impegnati "in vivo". I dati ottenuti indicheranno uno o più fattori che maggiormente sono implicati nella trascrizione basale del gene hsp70 inducibile. Inoltre per chiarire il ruolo di questa proteina da stress, ma sintetizzata in condizioni fisiologiche di crescita, inizialmente si determinerà la sua localizzazione subcellulare, in modo da focalizzare un eventuale suo ruolo. Inoltre saranno terminati gli esperimenti riguardanti la risposta allo stress di embrioni di riccio di mare sottoponendo gli embrioni a concentrazioni differenti di vari agenti inquinanti (ioni di metalli pesanti). Si valuterà la tossicità osservando la morfologia degli embrioni durante lo sviluppo e analizzando l’espressione della proteina HSP70 indicatore noto di stress cellulare. Metodologie Per determinare i fattori di trascrizione critici per la trascrizione basale del gene hsp70 saranno fatti esperimenti di mappatura della cromatina “in vivo”. Si seguirà la metodica di immunoprecipitazione della cromatina adoperando anticorpi specifici contro i fattori di trascrizione che possano avere un ruolo attivo. Tra questi verrà preso in considerazione il fattore di trascrizione Ku, adoperando il suo specifico anticorpo. Lo stato della cromatina "in vivo" verrà bloccato mediante fissazione con formaldeide e la cromatina verrà frammentata mediante sonicazione in frammenti di lunghezza media di circa 1kb. I frammenti di cromatina saranno immunoprecipitati con l’anticorpo specifico e il DNA sarà purificato dai frammenti immunoprecipitati dopo aver fatto un “cross-linking reverse”. Sarà quindi analizzato il prodotto di amplificazione adoperando primers che amplificano le consensus contenute nel promotore del gene hsp70. La localizzazione della proteina HSP70 sarà determinata al microscopio confocale mediante immunofluorescenza, adoperando anticorpi specifici. Saranno fatti anche frazionamenti cellulari e la presenza della proteina sarà visualizzata mediante western blot con l’anticorpo specifico. Inoltre si studierà se la proteina HSP70 sia associata alla membrana plasmatica, mediante la preparazione di microdomini della membrana plasmatica. Infatti secondo la letteratura una tale localizzazione potrebbe favorire un suo rilascio nell’ambiente extracellulare. Sarà continuata la ricerca sullo stress in embrioni di riccio di mare che sono critici nell’equilibrio della catena trofica di ambiente marino. Lo sviluppo degli embrioni di riccio di mare, dopo trattamento con vari agenti inquinanti, sarà valutato mediante osservazione al microscopio ottico e fotografie degli stessi per esaminarne statisticamente la morfologia. La sintesi dell’HSP70 sarà valutata negli embrioni trattati e negli embrioni controllo, mediante osservazione al microscopio confocale facenso uso di anticorpi anti HSP70. La sintesi quantitativa sarà valutata tramite marcatura con metionina 35S esuccessive autoradiografie di elettroforesi mono e bidimensionali. Analisi western blot saranno utilizzate per valutare eventuali variazioni nelle isoforme di HSP70.
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/06 → …

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