Resistenza a stress cellulari di cellule staminali di topo e di cellule embrionali di riccio di mare

Progetto: Research project

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La ricerca intrapresa riguarda lo studio dei meccanismi molecolari mediante i quali le cellule sottoposte a stress di varia natura (ambientali, infettivi, infiammatori) cercano di evitare danni cellulari che altrimenti potrebbero avviarle verso morte cellulare. A questo scopo si intende affrontare questo studio in due sistemi differenti, ma significativi: cellule staminali di topo ed embrioni di riccio di mare. Le cellule staminali potrebbero essere recruitate in aree di tessuti danneggiati e in rigenerazione, dove citochine infiammatorie e cellule citotossiche possono produrre severi danni cellulari. Gli embrioni di riccio di mare rappresentano un importante anello della catena trofica di ambiente marino. In particolare essi sono molto vulnerabili agli stress indotti da agenti inquinanti, perché una perturbazione nell’espressione genica dei primi stadi può avere un enorme impatto sul loro sviluppo. Si intende quindi sottoporre le cellule staminali in coltura a tre differenti stress: 1) calore, 2) trattamento con metallo pesante, 3) stress osmotico, analizando la sintesi della proteina HSP70 quale indicatore di stress cellulare. Nel caso degli embrioni di riccio di mare verrà analizzata l’influenza di vari agenti inquinanti (ioni di metalli pesanti) sullo sviluppo embrionale, sia sul piano morfologico, che sul piano biochimico, mediante la valutazione della sintesi della proteina HSP70. In ambedue i casi verrà studiato il meccanismo di attivazione trascrizionale della proteina HSP70. Verranno adoperate metodologie molecolari e biochimiche.

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Obiettivi L’obiettivo di questa ricerca è quello di studiare in due differenti sistemi cellulari (cellule staminali di topo ed embrioni di riccio di mare) la capacità di rispondere a stress ambientali e di vedere con quali meccanismi molecolari si attua la difesa cellulare. A) Risposta allo stress in cellule staminali, mesangioblasti, di topo. E’ nostra intenzione vedere se cellule staminali di topo, mesangioblasti della linea A6 ottenuti dall’aorta dorsale allo stadio embrionale 9.5, sono capaci di rispondere a differenti stress cellulari. Si intende quindi sottoporre le cellule in coltura a tre differenti stress: 1) calore, 2) trattamento con metallo pesante, 3) stress osmotico, analizando la sintesi della proteina HSP70 quale indicatore di stress cellulare. Dopo ogni stress sarà analizzata la sopravvivenza delle cellule e verranno analizzati parametri molecolari biochimici. Verrà valutata la sintesi della proteina HSP70 e sarà analizzato il meccanismo di attivazione della risposta inducibile nei differenti stress cellulari. Saggi riguardanti il fattore di trascrizione HSF1 permetteranno di valutare il suo stato di attivazione e il suo coinvolgimento. B) Risposta allo stress in embrioni di riccio di mare Verrà analizzata l’influenza di vari agenti inquinanti (ioni di metalli pesanti) sullo sviluppo di embrioni di riccio di mare sia sul piano morfologico di sviluppo, che sul piano biochimico, mediante la valutazione della sintesi della proteina HSP70. Anche nel caso degli embrioni di riccio di mare verrà studiato il meccanismo di attivazione della trascrizione dei geni hsp70 e il coinvolgimento del fattore di trascrizione HSF1, in rapporto agli agenti inquinanti usati. Metodologie La vitalità delle cellule staminali A6 verrà valutata tramite colorazione con Trypan blu. L’espressione dell’HSP70 inducibile sarà valutata tramite marcatura metabolica con Metionina 35S. Verranno preparati estratti proteici da utilizzare in: 1) saggi di western blot, utilizzando anticorpi specifici per HSP70 inducibile o HSF1; 2) saggi di mobilità elettroforetica mono e bidimensionale. Sarà valutata anche l’espressione dell’mRNA tramite saggi di RT-PCR. Lo sviluppo degli embrioni di riccio di mare, dopo trattamento con vari agenti inquinanti, sarà valutato mediante osservazione al microscopio ottico e fotografie degli stessi per esaminarne statisticamente la morfologia. La sintesi di HSP70 sarà valutata negli embrioni trattati e negli embrioni controllo, mediante osservazione al microscopio confocale facendo uso di anticorpi anti HSP70. La sintesi quantitativa sarà valutata tramite marcatura metabolica con Metionina 35S e successive autoradiografie di elettroforesi mono e bidimensionale. Analisi western blot saranno utilizzate per valutare eventuali variazioni nelle isoforme di HSP70. 2.3 Base di partenza scientifica (con eventuali riferimenti bibliografici) Le cellule rispondono a stimoli ambientali avversi quali: concentrazioni tossiche di metalli pesanti, innalzamento di temperatura, variazioni nei livelli degli osmoliti, infezioni e malattie, aumentando l’espressione di specifici geni chiamati geni heat shock, la cui espressione gioca un importante ruolo nella protezione cellulare (Lindquist et al. Annu. Rev. Genet. 1998 22: 631-677). Le proteine heat shock sono classificate in differenti famiglie sulla base del loro peso molecolare e la più conservata è la proteina Hsp70, che può essere usata anche come marker di stress (Mukhopadhyay et al. J. Biochem: Mol. Toxicol. 2003 17: 249-254). Le proteine da stress funzionano come chaperone molecolari riparando proteine danneggiate e mantenendole in uno stato di avvolgimento intermedio (Hartl Nature 1996 381: 571-580). Le Hsp70 inducibili dai vari stress sono infatti chiamate anche proteine della vita in quanto rendono le cellule resistenti all’apoptosi ed all’azione di sostanze citotissiche. Le cellule staminali devono essere capaci
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/04 → …

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