Regolazione dell'espressione di varianti istoniche differenziative nel cervello di ratto in sviluppo ed in sistemi modello di cellule cerebrali in coltura

Progetto: Research project

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Da diversi anni studiamo a livello molecolare il differenziamento terminale dei neuroni di cervello di mammifero, sia in vivo che in diversi sistemi di colture cellulari. Questi studi hanno permesso di scoprire che, nel corso della maturazione del sistema nervoso centrale, la cromatina di molte componenti cellulari del cervello subisce modificazioni strutturali e di composizione, che dipendono, a loro volta, dalla sintesi e dall'ingresso nel nucleo di varianti istoniche differenziamento-specifiche. Il dato forse più interessante è poi che la sintesi di queste proteine è regolata soprattutto a livello post-trascrizionale e dipende probabilmente dall'nterazione tra mRNA istonici e proteine RNA-leganti. Il programma di ricerca qui presentato è la continuazione di un progetto che si propone di esplorare il rapporto tra espressione replicazione-indipendente delle varianti istoniche H1° ed H3.3 e la sintesi, appunto, di alcune proteine RNA-leganti, scoperte nel nostro laboratorio ed espresse prevalentemente o esclusivamente durante la maturazione del cervello di ratto. Tra i fattori individuati, una p40, una p70 ed una p110, non ancora ben caratterizzate, e due proteine (PIPPin ed LPI) codificate da due cDNA da noi clonati. Queste proteine mostrano una certa specificità per gli mRNA istonici, seppure ciascuna in grado diverso. Il progetto si propone in primo luogo di identificare il livello d'azione delle proteine PIPPin, LPI (Long PEP-19 Isoform) e possibilmente PEP-19, già clonate, e delle 3 proteine p40, p70 e p110. Si continuerà, inoltre, la ricerca dei segnali extracellulari che modulano l'attività di tali fattori, regolando la sintesi delle citate proteine istoniche. Nel caso di PIPPin, per esempio, abbiamo appena scoperto che una frazione della PIPPin nucleare è legata alla cromatina stabilmente ed è sumoilata in risposta al trattamento con ormoni tiroidei. Partendo poi dall'ipotesi che il metabolismo dell'RNA sia regolato all'interno di strutture complesse, contenenti diversi RNA e diverse proteine regolatrici, un aspetto nuovo che il presente progetto propone è quello di individuare altre proteine che interagiscano con i fattori RNA-leganti già in corso di studio. In sintesi, quindi, il presente progetto si propone di approfondire: -lo studio mirato a definire meglio le proprietà di legame della PIPPin e della LPI, da una parte, e delle p40/70/110, dall'altra, nelle interazioni con gli mRNA H1° ed H3.3; - l'analisi del ruolo e del meccanismo d'azione delle diverse RNP individuate nella regolazione dell'espressione degli istoni H1° ed H3.3, in neuroni isolati da cervello di ratto fetale ed in diverse linee cellulari (per esempio, PC12); - lo studio delle modificazioni post-traduzionali della PIPPin (fosforilazione e sumoilazione); Il progetto, infine, mira ad individuare ulteriori proteine coinvolte, insieme a PIPPin e ad altre RNP già identificate, nella regolazione del metabolismo degli mRNA istonici.

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Obiettivi: Obiettivo generale del progetto proposto è quello di comprendere i meccanismi che regolano, nel corso della maturazione del cervello, l'espressione replicazione-indipendente di alcune varianti istoniche differenziative (H1° ed H3.3), nei diversi tipi cellulari (neuroni e glia). Sappiamo già che il controllo della sintesi di queste proteine cromatiniche è in larga misura post-trascrizionale e riteniamo che nella regolazione siano coinvolte diverse proteine RNA-leganti. Un primo importante obiettivo del progetto è, quindi, quello di identificare il livello d'azione delle proteine RNA-leganti PIPPin ed LPI (Long PEP-19 Isoform), già clonate, e delle 3 proteine p40, p70 e p110, tutte scoperte nel laboratorio proponente. Sarebbe, inoltre, di grande interesse l'individuazione di alcuni almeno dei segnali extracellulari che modulano l'attività di tali fattori, regolando la sintesi delle citate proteine istoniche. Abbiamo già scoperto, per esempio, che esistono due popolazioni nucleari di PIPPin: una acida, che dovrebbe essere quella capace di legare gli mRNA, ed una basica, fortemente legata alla cromatina. Una parte della PIPPin basica viene sumoilata in maniera dipendente dagli ormoni tiroidei. Un secondo obiettivo è quello di individuare altre proteine che interagiscano con i fattori RNA-leganti già in corso di studio. E' ormai evidente, infatti, che il metabolismo dell'RNA è regolato all'interno di strutture complesse, contenenti diversi RNA e diverse proteine regolative. Contiamo, in particolare, di: 1) Continuare le analisi mirate a definire meglio le proprietà di legame della PIPPin e della LPI, da una parte, e delle p40/70/110, dall'altra, nelle interazioni con gli mRNA H1° ed H3.3; 2) Approfondire lo studio del ruolo e del meccanismo d'azione della PIPPin e della LPI nella regolazione dell'espressione delle varianti istoniche H1° ed H3.3, in neuroni isolati da cervello di ratto fetale, coltivati in un terreno chimicamente definito (Maat Medium, MM) ed in diverse linee cellulari (tra le quali: cellule di neuroblastoma murino ed umano, e cellule PC12); 3) Approfondire lo studio delle modificazioni post-traduzionali della PIPPin (fosforilazione e sumoilazione); 4) Tentare con metodiche diverse l'individuazione di proteine leganti PIPPin e/o LPI. Metodologie: 1. Per studiare l'effetto dell'espressione di PIPPin sulla sintesi delle varianti istoniche H1° ed H3.3, un vettore eucariotico opportuno, contenente l'inserto PIPPin sarà trasfettato in cellule di origine neurale e non (es: cellule PC12 e linee continue di fegato o di rene). Saranno quindi selezionate e propagate le linee che esprimono stabilmente l'inserto. Linee cellulari che esprimono stabilmente LPI (come anche la sua isoforma breve, PEP-19) sono state, invece, già ottenute. 2. Da cervello di ratto in sviluppo, da colture primarie di cellule cerebrali e dalle linee stabilmente trasfettate saranno preparati lisati totali e frazionati, sui quali saranno condotte analisi "western"; 3. Per identificare altre proteine nucleari/citoplasmatiche che interagiscono con PIPPin/LPI/PEP-19 useremo due approcci alternativi: a) separazione per cromatografia di affinità delle frazioni proteiche nucleari o citoplasmatiche, su colonne contenenti la proteina RNA-legante ricombinante (per es: PIPPin), immobilizzata. Le proteine legate saranno poi eluite, analizzate per elettroforesi ed eventualmente identificate per spettrometria di massa; b) preparazione di una libreria fagica d'espressione (da cervello in sviluppo) ed analisi della stessa per legame con la proteina ricombinante marcata. Gli approcci metodologici menzionati sopra sono stati da noi già usati e descritti in precedenza. Si veda, ad esempio: Scaturro M., et al. (1998) J.Biol.Chem. 273:22788-22791 (preparazione di vettori ricombinanti; preparazione di estratti tissutali; sintesi in vitro di mRNA radioattivi; saggio di p
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/07 → …

Fingerprint

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