Regolazione dell'espressione di varianti istoniche differenziative nel cervello di ratto in sviluppo ed in sistemi modello di cellule cerebrali in coltura

Progetto: Research project

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Negli anni precedenti abbiamo studiato a livello molecolare il differenziamento terminale dei neuroni di cervello di mammifero, sia in vivo che in opportuni sistemi di colture cellulari, scoprendo che gli eventi che accompagnano la maturazione del cervello di ratto coinvolgono modificazioni dell'organizzazione strutturale e della composizione della cromatina neuronale. Tali modificazioni sembrano dipendere dalla sintesi e dall’ingresso nel nucleo di varianti istoniche differenziamento-specifiche. Abbiamo anche dimostrato che la sintesi di queste proteine è regolata soprattutto a livello post-trascrizionale. Il progetto, già in corso da più di un anno, si propone di esplorare il rapporto tra espressione replicazione-indipendente delle varianti istoniche H1° ed H3.3 e la sintesi di alcune proteine RNA-leganti, scoperte nel nostro laboratorio ed espresse prevalentemente o esclusivamente durante la maturazione del cervello di ratto. Tra i fattori individuati, una p40, una p70 ed una p110, non ancora ben caratterizzate, e due proteine (PIPPin ed LPI) codificate da due cDNA da noi clonati. Tutte queste proteine sembrerebbero dotate di una certa specificità nei confronti degli mRNA istonici, seppure ciascuna lo sia in grado diverso. Altro obiettivo del progetto è indagare sui possibili segnali extracellulari che regolano a monte il differenziamento delle cellule nervose, possibilmente attraverso un controllo delle interazioni tra mRNA istonici e fattori regolativi. Nel corso dell'anno precedente, abbiamo già cominciato a studiare il ruolo degli ormoni tiroidei (dei quali è d’altra parte nota la capacità di partecipare a fenomeni di rimodellamento della cromatina) nella regolazione dei livelli di espressione della PIPPin, proteina che, come si è detto, potrebbe giocare un ruolo essenziale nel trasporto degli mRNA istonici maturi al citoplasma e nel controllo della loro traduzione. Queste prime analisi ci hanno permesso di individuare una modificazione post-traduzionale della PIPPin che dipende dagli ormoni tiroidei. Si tratta di una sumoilazione che sembra regolare la localizzazione intranucleare della proteina. Abbiamo, inoltre, scoperto che esiste una forma basica di PIPPin che si lega saldamente alla cromatina. Per tutte queste analisi abbiamo usato, in aggiunta agli estratti di tessuto, anche neuroni corticali di ratto, coltivati in un terreno chimicamente definito, privo di siero. Continuando su questa strada, contiamo di approfondire lo studio riguardante gli ormoni tiroidei, verificando l'eventuale effetto di questi ormoni anche sulle altre proteine RNA-leganti individuate. Inoltre, analizzeremo l'effetto della sumoilazione della PIPPin sulla sua capacità di legare mRNA istonici ed eventualmente altre proteine nucleari.

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Obiettivi Obiettivo generale del progetto proposto è quello di arrivare a comprendere i meccanismi che regolano la sintesi replicazione-indipendente delle varianti istoniche H1° ed H3.3 ed il loro ingresso nella cromatina, nel corso del differenziamento neuronale. In primo luogo, si sta tentando di identificare il livello d’azione delle proteine RNA-leganti PIPPin ed LPI (Long PEP-19 Isoform), già clonate, e delle 3 proteine p40, p70 e p110, tutte scoperte nel laboratorio proponente. In secondo luogo, stiamo studiando i segnali extracellulari che potrebbero modulare l’attività di tali fattori, regolando la sintesi delle citate proteine istoniche. Per quanto riguarda questo aspetto, abbiamo già iniziato da oltre un anno a studiare gli effetti degli ormoni tiroidei (T3, in particolare) ed abbiamo già ottenuto degli interessanti risultati che riguardano la PIPPin; in particolare, si è trovato che esistono due popolazioni nucleari di PIPPin: una acida, che dovrebbe essere quella capace di legare gli mRNA, ed una basica, fortemente legata alla cromatina. Una parte della PIPPin basica viene sumoilata in maniera T3-dipendente . Contiamo adesso, in particolare, di: 1) Continuare le analisi mirate a definire meglio le proprietà di legame della PIPPin e della LPI, da una parte, e delle p40/70/110, dall'altra, nelle interazioni con gli mRNA H1° ed H3.3; 2) approfondire lo studio del ruolo e del meccanismo d’azione della PIPPin e della LPI nella regolazione dell’espressione delle varianti istoniche H1° ed H3.3 in neuroni isolati da cervello di ratto fetale, coltivati in un terreno chimicamente definito (Maat Medium, MM) ed in diverse linee cellulari (tra le quali: cellule di neuroblastoma murino ed umano, e cellule PC12); 3) studiare l’effetto degli ormoni tiroidei sull’espressione e sulla localizzazione intracellulare delle diverse proteine RNA-leganti, in cellule in coltura (sia neuroni corticali purificati che cellule trasfettate con vettori che esprimono PIPPin o LPI); a questo proposito, bisogna precisare che abbiamo già ottenuto linee cellulari stabilmente trasfettate con un vettore-LPI ma non ancora linee cellulari stabilmente trasfettate con un vettore-PIPPin. 4) approfondire lo studio degli effetti post-traduzionali dei TH sulla funzione della PIPPin; sulla base dei risultati già ottenuti, cercheremo soprattutto di capire quale possa essere l'effetto della sumoilazione T3-dipendente sulle funzioni della PIPPin. Metodi 1. L’effetto degli ormoni tiroidei sulla concentrazione e/o sull'attività legante dei diversi fattori già identificati (p40/70/110) sarà studiato mediante saggi di protezione dalla digestione con ribonucleasi T1, da condurre usando in parallelo lisati di cervello di ratto eutiroideo ed ipotiroideo; 2.Per studiare l'effetto dell'espressione di PIPPin sulla sintesi delle varianti istoniche H1° ed H3.3, un vettore eucariotico opportuno, contenente l’inserto PIPPin sarà trasfettato in cellule di origine neurale e non (es: cellule di neuroblastoma murino ed umano, e cellule PC12). Saranno quindi selezionate e propagate le linee che esprimono stabilmente l'inserto; linee cellulari che esprimono stabilmente LPI sono, invece, già state ottenute. 3. Da cervello di ratto in sviluppo, da colture primarie di cellule cerebrali e dalle linee stabilmente trasfettate saranno preparati lisati totali e frazionati, sui quali saranno condotte analisi "western"; 4. Le colture primarie e le linee cellulari trasfettate stabilmente saranno sottoposte al trattamento con ormoni tiroidei. Si studierà, quindi, la distribuzione subcellulare delle diverse proteine RNA-leganti mediante analisi western ed immunofluorescenza; Gli approcci metodologici menzionati sopra sono stati da noi già usati e descritti in precedenza. Si veda, ad esempio: Scaturro M., Nastasi T., Raimondi L., Bellafiore M., Cestelli A, and Di Liegro I., 1998, J.Biol.Chem. 273:22
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/06 → …

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