REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE DI VARIANTI ISTONICHE DIFFERENZIATIVE NEL CERVELLO DI RATTO IN SVILUPPO ED IN SISTEMI MODELLO DI CELLULE CEREBRALI IN COLTURA

Progetto: Research project

Dettagli progetto

Description

Sulla base delle precedenti ricerche condotte dai proponenti, è possibile ipotizzare che almeno alcuni degli eventi fondamentali per la maturazione del cervello di mammifero coinvolgano modificazioni dell'organizzazione strutturale e della composizione della cromatina neuronale. Tali modificazioni sembrano dipendere dalla sintesi e dall’ingresso nel nucleo di varianti istoniche differenziamento-specifiche. D'altra parte, la sintesi di queste proteine è regolata soprattutto a livello post-trascrizionale.

Il progetto si propone di esplorare il rapporto tra espressione replicazione-indipendente delle varianti istoniche H1° ed H3.3 e la sintesi di alcune proteine leganti RNA recentemente scoperte nel laboratorio dei proponenti ed espresse prevalentemente o esclusivamente durante la maturazione del cervello di ratto. Tra i fattori individuati, sembrano particolarmente interessanti una p40, una p70 ed una p110, non ancora caratterizzate a livello molecolare. Inoltre, abbiamo in precedenza clonato altre due proteine (PIPPin ed LPI) che sembrerebbero dotate di attività RNA-legante e di una certa specificità nei confronti degli mRNA istonici.

In secondo luogo, il progetto si propone di indagare sui possibili segnali extracellulari che regolano a monte le interazioni tra mRNA istonici e fattori regolativi. Il punto di partenza sarà l’analisi dell’eventuale ruolo degli ormoni tiroidei (dei quali è d’altra parte nota la capacità di partecipare a fenomeni di rimodellamento della cromatina) nella regolazione dei livelli di espressione dei fattori RNA-leganti identificati nel cervello di ratto; fra questi, infatti, almeno PIPPin potrebbe giocare un ruolo essenziale nel trasporto degli mRNA istonici maturi al citoplasma e nel controllo della loro traduzione.
Per le analisi proposte si useranno, in aggiunta agli estratti di tessuto, anche due sistemi di cellule in coltura: i) cellule nervose, purificate da cervello di ratto in sviluppo e mantenute in un terreno sintetico, privo di siero, contenente o meno ormoni tiroidei e ii) linee cellulari di origine neurale e non, che mostrino o meno sintesi endogena di istoni H1° ed H3.3, ma che non esprimano i geni PIPPin e/o LPI; le linee cellulari scelte saranno studiate prima e dopo la trasfezione di opportuni vettori plasmidici, contenenti l’inserto codificante PIPPin o LPI.

Layman's description

Obiettivi

Lo studio proposto ha come obiettivo generale quello di individuare i meccanismi che regolano la sintesi replicazione-indipendente delle varianti istoniche H1° ed H3.3 ed il loro ingresso nella cromatina, durante il differenziamento terminale dei neuroni.
Sarà prima di tutto necessario identificare il livello d’azione delle proteine RNA-leganti PIPPin ed LPI (Long PEP-19 Isoform), già clonate, e delle 3 proteine p40, p70 e p110, tutte scoperte nel laboratorio dei proponenti.
In secondo luogo, si tenterà di individuare i segnali extracellulari che modulano l’attività di tali fattori, regolando la sintesi delle proteine istoniche varianti. Per quanto riguarda questo aspetto, si inizierà dallo studio dei possibili effetti degli ormoni tiroidei (TH). A proposito di questi ormoni sappiamo già, infatti, che:
1. giocano un ruolo chiave nella maturazione del Sistema Nervoso Centrale (SNC);
2. nel corso della maturazione del cervello aumenta l’espressione delle diverse isoforme (alfa e beta) dei loro recettori (TR), con una comparsa precoce delle isoforme di tipo alfa. Nella stessa fase di sviluppo, si accumulano nella cromatina neuronale isoforme differenziative di istoni, come l’istone ‘linker’ H1° e l’istone ‘core’ H3.3. Queste ultime modificazioni non dipendono dall’attivazione dei corrispondenti geni istonici (che sono trascrizionalmente attivi anche in precedenza) ma da modificazioni post-trascrizionali, presumibilmente controllate da proteine RNA-leganti capaci di regolare il metabolismo degli mRNA istonici.
In quest'ottica, è suggestiva l'ipotesi che i geni bersaglio dei TH, non ancora identificati, nel cervello di ratto in sviluppo, possano essere quelli che codificano proteine come PIPPin ed LPI e/o p40/70/110.

Contiamo quindi, in particolare, di:

1) Definire meglio le proprietà di legame della PIPPin e della LPI, da una parte, e delle p40/70/110, dall'altra, nelle interazioni con gli mRNA H1° ed H3.3;
2) Chiarire il ruolo ed il meccanismo d’azione della PIPPin e della LPI nella regolazione dell’espressione delle varianti istoniche H1° ed H3.3 in neuroni isolati dal cervello di ratto fetale e coltivati in un terreno chimicamente definito (Maat Medium, MM);
3) Studiare l’effetto dell’espressione forzata della PIPPin e della LPI sull’espressione delle varianti istoniche H1° ed H3.3, in diverse linee cellulari (tra le quali: cellule di neuroblastoma murino ed umano, e cellule PC12);
4) Studiare l’effetto degli ormoni tiroidei sull’espressione e sulla localizzazione intracellulare delle diverse proteine RNA-leganti, in cellule in coltura (sia neuroni corticali purificati che cellule trasfettate con vettori che esprimono PIPPin o LPI);
5) Studiare l’eventuale effetto degli ormoni tiroidei sulla concentrazione e/o capacità legante delle proteine che legano i due RNA istonici.

Metodi

1. Per studiare l'effetto dell'espressione forzata di PIPPin e/o LPI sulla sintesi delle varianti istoniche H1° ed H3.3, vettori eucariotici opportuni, contenenti l’inserto che codifica PIPPin o LPI, saranno trasfettati in cellule di origine neurale e non (tra le quali: cellule di neuroblastoma murino ed umano, e cellule PC12). Saranno quindi selezionate e propagate le linee che esprimono stabilmente gli inserti;

2. Da cervello di ratto in sviluppo, da colture primarie di neuroni (ed eventualmente astrociti) e dalle linee stabilmente trasfettate (punto 1) saranno preparati lisati totali e frazionati (frazione post-nucleare, estratti nucleari, frazione HCl-solubile, ecc); su queste frazioni saranno condotte analisi "western";

3. Le colture primarie e le linee cellulari trasfettate stabilmente saranno sottoposte al trattamento con ormoni tiroidei. Si studierà, quindi, la distribuzione subcellulare delle diverse proteine RNA-leganti mediante analisi western ed immunofluorescenza;

4. L’effetto degli ormoni tiroid
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/04 → …

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