REDUPLICAZIONE DEI CENTROSOMI IN FIBROBLASTI UMANI PRB DEFICIENTI E INSTABILITA’ CROMOSOMICA

La maggior parte dei tumori umani è caratterizzata sia da instabilità cromosomica (CIN) sia da amplificazione dei centrosomi. Quest'ultima è stata correlata con l’instabilità cromosomica osservata sia in tumori aggressivi che in lesioni pre-neoplastiche. L'obiettivo generale è quello di comprendere il/i meccanismo/i alla base dell 'instabilità cromosomica in cellule di mammifero analizzando la possibile correlazione tra fenotipo CIN e alterazioni in geni oncosoppressori e in geni coinvolti nell'omeostasi dei centrosomi. In particolare sarà investigato se la presenza di centrosomi soprannumerari in cellule deficienti per i geni oncosoppressori pRb e p53, sia una condizione sufficiente per innescare e perpetuare l'aneuploidia.

2.1 Obiettivi Dati preliminari ottenuti in cellule HCT116 (fenotipo MIN), nulle per p21, p53, o esprimenti le oncoproteine virali E6 ed E7, hanno mostrato che la presenza dei centrosomi soprannumerari non ha indotto aneuploidia, suggerendo che altri geni coinvolti nella stabilità genetica e/o omeostasi dei centrosomi debbano essere mutati. Come causa possibile dell'origine di CIN, sarà valutato l’effetto del silenziamento, tramite la strategia dell’RNA Interference, dei geni BRCA1, PLK1 e Aurora A. La tecnica dell' interferenza dell'RNA sarà applicata nelle cellule HCT116, p21 e p53 nulle e in cellule HCT116 esprimenti le oncoproteine virali E6 o E7. Questa strategia sarà utilizzata inoltre in cellule umani normali primarie. Gli effetti dell'RNA interference sarà dapprima valutata per ogni gene singolarmante. In un secondo tempo siRNAs differenti saranno trasfettati contemporaneamente per valutare un’eventuale associazione di funzionamento di questi geni. Nel caso che l'introduzione diretta del dsRNA sintetico (espresso in transient) non sia letale per le cellule, sarà effettuato il clonaggio in plasmidi approriati per la generazione di siRNA da esprimere stabilmente. Questo approccio permetterà di studiare gli effetti della riduzione prolungata di espressione del gene o dei geni in esame. Inoltre sarà modulato il numero dei centrosomi in fibroblasti umani sia normali sia deficienti in p53 e RB in modo da generare cellule con un numero multiplo di centrosomi e valutarne l’effetto sull’induzione di aneuploidia. Saranno valutate le anomalie nei centrosomi mediante analisi immunocitochimica utilizzando anticorpi anti-gamma tubulina, e la presenza di fusi mitotici multipolari mediante uso di anticorpi anti beta tubulina 2.2 Metodologie L'RNA interference consiste nel silenziamento post-trascrizionale di RNA messageri omologhi in sequenza a RNA a doppio filamento di lunghezza pari a 21-23 nt. Questi RNA a doppio filamento sintetizzati in vitro sono ritenuti potenti reagenti per mediare il silenziamento genico, e sono efficaci a concentrazioni molto più basse di quelle usate nelle strategie antisenso convenzionali. L'introduzione diretta dei dsRNA sarà effettuata mediante trasfezione per mezzo di un carrier lipidico (Lipofectamine 2000, Invitrogen). Come controllo negativo sarà utilizzato un siRNA nonspecifico diretto contro il gene della luciferasi. Dopo la trasfezione degli siRNA i lisati cellulari saranno sottoposti ad analisi western blot per valutare la riduzione di espressione della proteina corrispondente, mediante RT-PCR sarà valuatata la riduzione del livello di mRNA corrispondente. Valutazione della distribuzione nel ciclo cellulare, re-replicazione del DNA e apoptosi mediante analisi citofluorimetrica in cellule tumorali HCT116 dopo la trasfezione con gli siRNA per BRCA1, PLK1 e Aurora A. Valutazione degli effetti degli siRNA sulla ploidia in cellule tumorali HCT116 con differente background genetico mediante analisi citogenetica e immunocitochimica. Trasfezione nelle cellule HCT116 dei plasmidi ricombinanti seguita dalla selezione delle cellule stabilmente trasfettate. Western blotting con anticorpi specifici per controllare l’effettiva delezione dei bersagli genici degli siRNA in cellule trasfettate. Esperimenti di RT-PCR per verificare gli effetti della presenza degli siRNA sui livelli dei messaggeri nelle cellule trasfettate. Valutazione degli effetti dell’espressione continua di siRNA in cellule trasfettate con diverso background genetico mediante analisi citogenetica e immunocitochimica.