PPAR-gamma come potenziale mediatore degli effetti apoptotici indotti dai cannabinoidi in cellule di epatoma umano in coltura

Il presente progetto di ricerca si propone di studiare il coinvolgimento di PPAR-gamma nel meccanismo apoptotico indotto dai cannabinoidi sintetici in cellule di epatoma. Questo fattore di trascrizione, oltre ad intervenire nel controllo del metabolismo glucidico e lipidico, nella modulazione dell’adipogenesi e della risposta infiammatoria, quando attivato da specifici ligandi, può avviare il processo di morte cellulare programmata. In letteratura sono presenti frammentarie evidenze che i cannabinoidi, in virtù della loro struttura chimica, ed in particolare il WIN, un cannabinoide sintetico che si comporta da agonista dei recettori per i cannabinoidi CB1/CB2, possono essere ligandi di PPAR-gamma. Nostri studi precedenti hanno dimostrato che il WIN induce apoptosi in cellule di epatoma e questo evento si accompagna a variazione dei livelli di alcune proteine la cui trascrizione può essere regolata da PPAR-gamma. Su queste premesse si basa la nostra ipotesi che PPAR-gamma possa svolgere un ruolo chiave nel mediare l’effetto apoptotico del WIN. Per confermare questa ipotesi noi intendiamo: - valutare i livelli di espressione di PPAR-gamma nelle cellule di epatoma e la loro variazione in seguito al trattamento con il cannabinoide sintetico WIN. Analisi di western blotting e Real-Time PCR saranno utilizzate per valutare rispettivamente i livelli della proteina e del suo mRNA. - valutare, mediante l’impiego dell’antagonista specifico dell’attività di PPAR-gamma (GW9662) o silenziamento genico, se le variazioni dei livelli delle proteine che svolgono un ruolo nell’evento apoptotico indotto dal WIN vengono annullate dalla riduzione dei livelli intracellulari di PPAR-gamma. Inoltre, l’analisi proteomica potrà fornirci importanti informazioni sui target trascrizionali di PPAR-gamma modulati dal WIN nel nostro modello sperimentale. Sicuramente interessanti potranno essere i risultati di una eventuale sensibilizzazione delle cellule HepG2 indotta dal WIN nei confronti del percorso apoptotico indotto da TRAIL. Tale fattore, riconosciuto per la sua attività proapoptotica in alcuni modelli tumorali, non può trovare un largo impiego a causa della resistenza sviluppata da alcuni citotipi tumorali. Questo ostacolo può essere superato con l’utilizzo di molecole in grado di attivare la via apoptotica TRAIL-dipendente ad esempio inducendo l’overespressione del suo recettore DR5. Poiché DR5 è target trascrizionale di PPAR-gamma, è plausibile ipotizzare che l’attivazione di tale fattore indotto dal WIN possa rappresentare una modalità di sensibilizzazione delle cellule all’azione di TRAIL. Tutto ciò potrebbe essere estremamente interessante e potrebbe gettare le basi per una sperimentazione clinica nel trattamento dell’epatoma, anche in considerazione del fatto che i ligandi di PPAR-gamma sono già usati routinariamente nel trattamento del diabete di tipo II e non sembrano indurre seri effetti collaterali.

Gli obiettivi del presente programma di ricerca sono riassumibili nei seguenti punti: • Valutare i livelli di espressione del fattore PPAR-gamma e del relativo messaggero in cellule di epatoma umano in coltura e l’eventuale loro variazione in seguito a trattamento con il cannabinoide sintetico WIN. • Valutare se le variazioni dei livelli delle proteine implicate nel percorso apoptotico indotto dal WIN possano essere una conseguenza della attivazione del fattore trascrizionale PPAR-gamma. A tale scopo valuteremo gli effetti di GW9662, un antagonista dell’attività trascrizionale di PPAR- gamma sulla vitalità cellulare e sui livelli dei fattori implicati nel percorso apoptotico indotto dal WIN. Dati bibliografici indicano che survivina, Bcl-2 e Bcl-XL subiscono un controllo negativo da parte di PPAR- gamma, mentre la lipido fosfatasi PTEN e il fattore pro-apoptotico bax vengono up-regolate. Un risultato positivo ci porterà a validare la nostra ipotesi anche mediante esperimenti di silenziameno genico di PPAR-gamma. • Valutare l’espressione di AKT e il suo stato di fosforilazione. Tale proteina è tra i principali fattori di sopravvivenza cellulare che si oppongono alla morte indotta dai cannabinoidi in cellule di epatoma. Nostri studi hanno dimostrato che in seguito al trattamento con WIN, la forma fosforilata attiva di AKT decrementa. Obiettivo è valutare, mediante l’impiego di inibitori specifici di PTEN, se la defosforilazione è conseguenza dell’attivazione trascrizionale PPAR-gamma-dipendente di PTEN. • Analizzare il pannello dei fattori regolati dall'attivazione di PPAR-gamma mediante analisi proteomica in presenza di WIN e/o dell’antagonista di PPAR-gamma. Tale analisi, in aggiunta alle classiche metodiche biochimiche, ci permetterà il monitoraggio delle variazioni dell’espressione proteica complessiva indotta dal WIN e dipendente da PPAR-gamma. • Valutare se il WIN è in grado di sensibilizzare le cellule di epatoma all’azione di TRAIL ricombinante. Le cellule HepG2 risultano resistenti all’azione di TRAIL, un ligando dei recettori di morte che mostra spiccata e specifica azione apoptotica in molti modelli di cellule tumorali. Poiché è noto che l’attivazione di PPAR-gamma può indurre down-regulation di c-Flip e up-regulation di DR5, due fattori implicati nel percorso apoptotico indotto da TRAIL, noi ci aspettiamo che il WIN possa, attraverso l’attivazione di PPAR-gamma sensibilizzare le cellule HepG2 alla morte indotta da TRAIL. Metodologie Lo studio sarà condotto sulla linea cellulare di epatoma umano in coltura HepG2. Per studiare il possibile coinvolgimento del fattore trascrizionale PPAR-gamma nel meccanismo apoptotico indotto dal WIN verranno valutati i livelli della proteina e dei fattori pro- ed anti-apoptotici che sono noti essere target di PPAR-gamma impiegando tecniche di western blotting con l’uso di anticorpi specifici per le proteine in esame. Il quadro proteico complessivo dato dal trattamento con WIN verrà valutato attraverso analisi bidimensionale. A tal fine, le proteine estratte dalle cellule di epatoma verranno sottoposte ad una prima separazione in base al loro punto isoelettrico (mediante isoelettrofocalizzazione) e ad una successiva separazione in base al loro peso molecolare (mediante tecnica SDS-PAGE), utilizzando il sistema bidimensionale fornito dalla BioRad. Seguirà lo studio densitometrico degli spot ottenuti mediante il programma “PDQuest 2D Gel Analysis” e la individuazione delle proteine mediante anticorpi specifici. I livelli del messaggero di PPAR-gamma verranno studiati tramite Real-Time PCR con iCycler IQ5 Real Time-PCR Detection System impiegando oligo-nucleotidi specifici marcati con fluorocromi. I risultati verranno analizzati impiegando IQ5 Optical System Software della Biorad. L’attività di binding al DNA di PPAR- gamma verrà studiata e quantizzata mediante immunofluorescen