OTTENIMENTO IN VITRO DI CELLULE RENALI DA CELLULE STAMINALI PROVENIENTI DA CORDONE OMBELICALE UMANO, PER LA TERAPIA CELLULARE DELL’ INSUFFICIENZA RENALE

Le tecniche emodialitiche ma soprattutto il trapianto di rene in questi ultimi trent’anni hanno radicalmente cambiato la storia naturale dell’insufficienza renale. Se da un canto l’emodialisi ha enormemente aumentato la sopravvivenza dei pazienti affetti da insufficienza renale cronica, di contro la carenza di organi disponibili non ha garantito con il trapianto renale l’esaurimento delle liste d’attesa. Anche il trapianto di rene che ormai ha raggiunto degli standard clinici soddisfacenti non garantisce però la guarigione a lungo termine per le complicanze legate all’atto chirurgico ed alla terapia immunosoppressiva; il rigetto cronico rimane ancora la causa principale di fallimento del trapianto. Per tale motivo oggi risulta sempre più importante la ricerca di terapie alternative Da ciò nasce l’esigenza di esplorare un nuovo campo di sperimentazione che vede l’uso di cellule staminali , le quali hanno insite nella loro espressione genica il potere di rimodellamento e rimarginazione dei tessuti danneggiati. Scopo della nostra ricerca è quello di ottenere in vitro cellule renali a partire da stem-cells isolate dal cordone ombelicale umano, quale potenziale fonte terapeutica per le nefropatie degenerative-cellulari o in corso di ATN post-trapianto , o per il recupero di reni marginali da donatore cadavere marginale. Fasi di svolgimento del progetto 1. Standardizzazione della tecnica isolamento e purificazione di cellule staminali provenienti da cordone ombelicale umano; 2. Coltivazione ed espansione e differenziazione in vitro in renal like cells Obbiettivi Durante la fase 1 ;ottenimento di cellule staminali provenienti dal cordone ombelicale umano Durante la fase 2 : espansione e differenziazione in vitro di cellule staminali ottenute Conclusioni Pertanto tale progetto di ricerca qualora rispettasse gli obbiettivi prefissati potrebbe avere l’importante risvolto clinico risolvendo in primo luogo l’annoso problema della scarsa disponibilità di organi per ciò che attiene i pazienti in lista d'attesa per trapianto,in secondo luogo di risolvere meglio e precocemente i problemi legati all’ATN post-trapianto, in terzo luogo la possibilità di recupero di reni provenienti da donatori marginali grazie alla rigenerazione tissutale legata alle nuove linee cellulari per fuse all’interno del rene .Concludendo tale progetto si propone di dare un importante contributo alla ricerca italiana sui trapianti di rene, dando una spinta innovativa che ben si inserisce in una prospettiva di ricerca più ampia al passo con l’attuale sperimentazione internazionale.

Obiettivi:fase 1 ;ottenimento di cellule staminali provenienti dal cordone ombelicale umano fase 2 : espansione e differenziazione in vitro in cellule staminali renali Se i risultati laboratoristici confermeranno in vitro la potenzialità delle cellule staminali cordonali di differenziarsi in cellule renali, ciò apre la strada alla possibile applicazione clinica della rigenerazione e/o riparazione di tessuto renale su pazienti in insufficienza renale cronica in fase conservativa; sui reni da donatori marginali, nella necrosi tubulare acuta post-trapianto ed infine nella recidiva dell'insufficienza renale cronica in fase conservativa post-trapianto. Metodi:Fase 1.Standardizzazione della tecnica isolamento e purificazione di cellule staminali provenienti da cordone ombelicale umano; Dalle unità di sangue placentare selezionate in base al gruppo ABO-HLA che non sono state “bancate”, perché non possiedono i criteri di accettabilità previsti per il trapianto allogenico, (ossia il volume superiore a 60 ml e il numero di cellule nucleate totali ≥ a 800 x106), vengono separate, con l’utilizzo del gradiente di densità Ficoll-Hypaque, cellule mononucleate. Queste, dopo opportuni lavaggi con tampone e dopo essere state risospese, verranno contate ed etichettate come cellule CD34+ e saggiate con il Trypan Blu nella loro vitalità. Di queste cellule una aliquota verrà utilizzata mentre un’altra verrà trattata con D.M.S.O. al 10% e criopreservata in vapori di azoto alla temperatura di -196°C per essere utilizzata nella fase 2 Fase 2 :Coltivazione ed espansione in vitro di cellule renali Le cellule della prima aliquota dopo centrifugazione verranno risospese in tampone basico con una combinazione di HGF, FGF-1, FGF-2 ( fattori di proliferazione e differenziazione cellulare) e LIF (fattori inibenti la leucemia) e SCF (fattori di mantenimento per le cellule staminali) 40. Dopo una settimana dall’inizio della coltura verrà saggiata l’espressione dell’mRNA per Pax-2(fattore trascrizionale di proliferazione delle cellule renali metanefriche) mediante RT-PCR. Dopo 3 settimane di coltura verranno identificate mediante immoistochimica le cellule vimentina positive. Le cellule che esprimono questo marker verranno etichettate come renal progenitor like cells. Mentre una doppia colorazione immunoistochimica positiva per vimentina e PCNA(marker di proliferazione nucleare) dimostrerà che le cellule vimentina positive esprimono la potenzialità per la proliferazione in renal progenitor like cells.