NEUROMODULAZIONE DELLA ATTIVITÀ CONTRATTILE INTESTINALE: RUOLO DELL' ACIDO GAMMA-AMINOBUTIRRICO (GABA)

Il Sistema Nervoso Enterico (SNE) è formato da una rete di gangli e nervi, localizzata nella parete del canale alimentare, che regola e modula lo stato di contrattilità del muscolo liscio. Come tutti i neuroni, anche quelli del SNE possiedono la capacità di sintetizzare, immagazzinare e rilasciare, in risposta a stimoli adeguati, un’ampia gamma di messaggeri chimici, comparabile per numero a quelli presenti nel sistema nervoso centrale. Per molti di questi agenti chimici non si conoscono ancora l'origine, gli stimoli fisiologici che ne determinano il rilascio, il tipo di recettore implicato nella risposta osservata ed il meccanismo d’azione. Tali conoscenze si rendono necessarie da momento che alterazioni nella funzionalità nel SNE possono essere alla base dei cambiamenti della motilità osservati in alcuni stati patologici come ad esempio nell’ infiammazione. Scopo della presente ricerca è, pertanto, quello di analizzare i possibili neuromodulatori dell’attività meccanica ed elettrica di diversi segmenti dell’intestino di topo, focalizzando l'attenzione in primo luogo sul ruolo svolto dall’acido gamma-aminobutirrico (GABA). E’ noto che il GABA è il principale neurotrasmettitore inibitore del sistema nervoso centrale e che la sua azione è mediata dall’attivazione di recettori appartenenti a tre sottoclassi GABAA, GABAB, GABAC. Negli ultimi anni la presenza di neuroni immunoreattivi al GABA e di recettori per il GABA è stata dimostrata anche a livello del sistema nervoso enterico di diverse specie animali, suggerendo che essi possano svolgere un ruolo nella modulazione e nel controllo della motilità GI. Nei nostri studi verrà utilizzato come modello sperimentale il topo, modello sempre più importante per lo studio della motilità gastrointestinale grazie alla disponibilità di una grande varietà di mutanti. Si mira, pertanto, a caratterizzare le risposte indotte dalla somministrazione esogena di GABA e ad analizzare l’eventuale ruolo svolto nelle risposte indotte dalla stimolazione nervosa nelle diverse porzioni del tratto gastrointestinale. Inoltre, dal momento che il GABA svolge il suo effetto fisiologico attraverso l’attivazione di diversi sottotipi di recettori di membrana, suddivisi in recettori GABAA, GABAB, GABAC, ci si propone di identificare, i tipi di recettori coinvolti nelle diverse risposte analizzate, utilizzando sia tecniche farmacologiche che di biologia molecolare. Infine, servendoci di specifici agenti farmacologici valuteremo il sito di azione del GABA, verosimilmente a livello presinaptico, e i neuroni modulati da esso. Gli obiettivi di tale ricerca saranno quindi: - Analizzare in diverse porzioni del canale alimentare il ruolo svolto dai recettori GABAergici nella modulazione dell’attività dei neuroni enterici, inibitori ed eccitatori; - Identificare e localizzare i sottotipi di recettori coinvolti - Studiare le possibili interazioni tra il GABA ed altri neurotrasmettitori enterici, sia eccitatori che inibitori.

Nel presente progetto ci si propone di valutare ed analizzare, in preparati allestiti in vitro, il ruolo dell’acido gamma amino butirrico (GABA) come neuromodulatore dell’attività meccanica ed elettrica di diversi segmenti dell’intestino di topo. E’ noto che il GABA è il principale neurotrasmettitore inibitore del sistema nervoso centrale e che la sua azione è mediata dall’attivazione di recettori appartenenti a tre sottoclassi GABAA, GABAB, GABAC. Negli ultimi anni la presenza di neuroni immunoreattivi al GABA e di recettori per il GABA è stata dimostrata anche a livello del sistema nervoso enterico di diverse specie animali, suggerendo che essi possano svolgere un ruolo nella modulazione e nel controllo della motilità GI. I neuroni enterici GABAergici sembrano essere esclusivamente interneuroni e pertanto l’attivazione dei diversi recettori determina effetti variabili in considerazione della porzione del tratto GI e della specie animale considerata. Ad oggi, il ruolo del GABA sembra essere piuttosto complesso e non ancora pienamente caratterizzato. Nei nostri studi verrà utilizzato come modello sperimentale il topo, sempre più un modello sperimentale importante per lo studio della motilità gastrointestinale grazie facilità con cui è possibile manipolare il suo genoma e quindi alla disponibilità di una grande varietà di mutanti. Neuroni immunoreattivi al GABA ed elevati livelli endogeni di GABA sono stati riscontrati nel tratto GI del topo, ma mancano studi funzionali volti a chiarire il ruolo del GABA nella neurotrasmissione enterica in questa specie. Nella presente ricerca si cerca, pertanto, di caratterizzare le risposte indotte dalla somministrazione esogena del GABA sull’attività elettrica e contrattile nelle diverse porzioni del tratto gastrointestinale. Inoltre, dal momento che l’azione del GABA è mediata dall’attivazione di recettori appartenenti alle tre sottoclassi GABAA, GABAB GABAC posti sulla membrana cellulare, ci si propone, utilizzando non solo agonisti ed antagonisti selettivi per le diverse sottoclassi di recettori, ma anche mediante tecniche di biologia molecolare, di identificare i tipi di recettori coinvolti nelle risposte osservate ed espressi nei diversi segmenti analizzati. Infine servendosi di bloccanti dei diversi pathways neurali, sarà analizzata l’eventuale interazione del GABA con altri neurotrasmettitori enterici. Gli obiettivi di tale ricerca saranno quindi: - Analizzare in diverse porzioni del canale alimentare il ruolo svolto ed il meccanismo d’azione del GABA nelle vie inibitorie ed eccitatorie enteriche. - Identificare e localizzare i sottotipi di recettori coinvolti - Studiare le possibili interazioni tra il GABA ed altri neurotrasmettitori enterici, sia eccitatori che inibitori. Tale ricerca prevede: - l’uso di tecniche di registrazione dell’attività meccanica in vitro di segmenti e di strips di muscolatura liscia di diverse porzioni del canale alimentare di topo, in particolare intestino tenue e colon. I segmenti interi saranno montati in un bagno d’organo orizzontale per la registrazione sia della pressione endoluminale (espressione dell’attività meccanica della muscolatura circolare) che della tensione isometrica (espressione dell’attività meccanica della muscolatura longitudinale). Tale approccio sperimentale, permette di studiare la funzione muscolare in condizioni nelle quali sono escluse le influenze di fattori estrinseci, ma il muscolo funziona in modo analogo alle sue condizioni in vivo. Le strips di muscolatura circolare o longitudinale saranno montate in un bagno per organo verticale, al fine di analizzare separatamente le risposte dei due strati muscolari. - l’uso di tecniche elettrofisiologiche (derivazione microelettrodica intracellulare) per la registrazione dei potenziali di membrana assoluti, dell’attività elettrica spontanea e delle risposte alla stimolazione di ca