Metodologie drop on demand per la realizzazione di microarray funzionali per il drug screening

Progetto: Research project

Dettagli progetto

Description

Nell'ambito del progetto nazionale, l'unità di ricerca di Palermo (UdR-UniPa) si occuperà della realizzazione di metodologie innovative di non-contatto per lo screening di sistemi inibitori e/o modulatori basate su array funzionali supportati da superfici solide. La metodica proposta fa uso di tecniche di stampa a gettod'inchiostro (inkjet printing) caratterizzate da un'elevata risoluzione spaziale (scala dei micron) garantendo peraltro un elevato rapporto prestazione/costo. Verranno proposti alcuni approcci che si prefiggono di monitorare l'interazione ricettore/ligando e gli effetti che sulla stessa possono avere diversi composti inibitori e/o modulatori sintetizzati dall'Unità di Salerno. Si farà particolare riferimento a processi di natura enzimatica che coinvolgono enzimi quali: la glucosio-ossidasi, reperibile commercialmente, facilmente monitorabile e a basso costo che verrà utilizzata principalmente per la messa appunto degli approcci metodologici; il CYP3A4, il principale sistema coinvolto nel metabolismo dei farmaci; la p300, un "coattivatore trascrizionale globale" che ha un ruolo critico nella regolazione del ciclo cellulare. Gli enzimi di cui sopra verranno immobilizzati uno per volta su opportuni supporti solidi e soluzioni contenti agenti inibitori e/o modulatori in presenza dei substrati/target enzimatici verranno dispensate mediante inkjet printing secondo geometrie predefinite. In particolare si intende dispensare queste soluzioni realizzando array a: 1) spot circolari; 2) strisce incrociate. La configurazione 1 è di grande interesse per rilevare a livello di singolo spot l'effetto di diversi composti di sintesi sull'interazione enzima-substrato. La configurazione 2 permetterebbe invece di monitorare effetti combinati di differenti coppie di composti nei punti d'incrocio. Le strumentazioni tipo inkjet printing, già commerciali, presentano tipicamente configurazioni che possono avere da 16 a 250 nozzle che lavorano in parallelo. Ciò potrebbe portare, in principio, alla realizzazione di matrici che vanno dalle centinaia alle decine di migliaia di punti di incrocio garantendo quindi la possibilità di effettuare ampie statistiche e/o alla determinazione dell'attività di un numero altrettanto elevato di composti. Per la messa a punto di tali metodiche l'UdR-UniPA effettuerà una serie di studi intesi a: 1) funzionalizzare le superfici di ossido di silicio o di vetro con gli strati enzimatici; 2) determinare le condizioni sperimentali (strumentali e di formulazione degli inchiostri) ottimali per il rilascio delle soluzioni e l'ottenimento di pattern ben definiti e risolti spazialmente; 3) mettere a punto i saggi per la determinazione dell'attività enzimatica verificando quindi il potere inibitorio/modulatore dei composti di sintesi. I componentidell'UdR-UniPA si avvalgono di una notevole esperienza nello studio della struttura e delle proprietà di superfici e interfasi di sistemi organici e biologici su scala nanometrica, e per effettuare tali studi si avvarranno, in aggiunta alle tecniche inkjet printing di cui sopra, di metodologie di auto-assemblaggio e auto-organizzazione da soluzione per la realizzazione delle superfici e interfasi molecolari, nonché di strumenti di spettroscopia e microscopia di superficie avanzati per le caratterizzazioni.

Layman's description

Scopo del presente progetto è la realizzazione di metodologie innovative di non-contatto funzionali allo screening farmacologico, caratterizzate da un elevato rapporto prestazione/costo e basate su tecnologie di deposizione del tipo inkjet printing. Lo sviluppo metodologico si articolerà su alcuni approcci innovativi che si prefiggono di controllare l'interazione fra un recettore e un ligando in presenza di potenziali agenti inibitori, con particolare riferimento a processi di natura enzimatica.Verranno in particolare seguiti due approcci chimico-fisici differenti, qui sotto riportati:Approccio 1 - Un enzima viene ancorato omogeneamente ad una superficie solida e viene valutata l'interazione dello stesso con un substrato ("target") dispensando spot che contengono sistemi inibitori/modulatori enzimatici ("drug" in figura per semplicità)differenti in presenza del substrato. Il fenomeno d'interazione verrà valutato attraverso saggi colorimetrici o di fluorescenza.Approccio 2 Un enzima viene ancorato omogeneamente sul supporto solido e vengono dispensate strisce di potenziali inibitori e/o modulatori enzimatici a incrocio,in presenza del substrato. In questo modo é possibile valutare eventuali effetti di agonismo e/o antagonismo competitivo nei punti di incrocio.Durante la prima fase del progetto, gli approcci di cui sopra verranno messi a punto utilizzando la coppia glucosio-ossidasi/glucosio, come modello enzima/substrato, e la D-glucale come inibitore. La GOx è un enzima che catalizza l'ossidazione del ß-D-glucosio a -gluconolattone e perossido d'idrogeno mediante ossigeno molecolare.In particolare, è stato dimostrato che l'interazione altamente specifica fra glucosio ossidasi (GOx) e il P-D-glucosio viene inibita dalla D-glucale [M. J. Rogers and K. G. Brandt Biochemistry, 1971, 10 (25), 4624-4630]. Tale sistema è reperibile commercialmente, facilmente monitorabile (vedi saggio colorimetrico sottoriportato) e a basso costo. Inoltre, al fine di valutare differenze di interazione, verranno dispensati spot di D-glucale a pH variabile. A questo proposito é stato dimostrato che per la D-glucale la costante di inibizione può variare a pH superiori a 7.5 o inferiori a 3.8 [M. J. Rogers and K. G. Brandt Biochemistry, 1971, 10(25), 4624-4630].Nella seconda fase del progetto, gli approcci sopra riportati verranno estesi ad enzimi e coppie enzima/substrato di elevato interesse clinico/farmacologico.In particolare, verrà dapprima investigato il CYP3A4, un enzima appartenente alla famiglia del citocromo P450. Questo è il principale enzima coinvolto nel metabolismo dei farmaci (metabolismo di fase I). Molti farmaci possono aumentare o diminuire l'attività enzimatica delle isoforme CYP, o venire da esse rapidamentemetabolizzati. Lo studio di questi effetti è di fondamentale importanza per lo sviluppo e l'uso clinico di farmaci con potenziali capacità d'interazione col CYP3A4. Il sistema prevede dunque l'utilizzo di CYP3A4 e di substrati e inibitori sintetizzati dalla UdR-SA. Questi ultimi verranno investigati utilizzando dapprima l'approccio 1per effettuare uno screening veloce di una collezione di composti e, successivamente, l'approccio 2 per valutare le eventuali interazioni tra farmaci.Infine, verrà studiato l'enzima p300, una istone acetiltransferasi (HAT) in grado di acetilare specifici residui di lisina sulla porzione N-terminale degli istoni H3 e H4.Questa é considerata un "coattivatore trascrizionale globale" ed ha un ruolo critico nella regolazione del ciclo cellulare, nella differenziazione e nell'apoptosi.Un'attività aberrante delle HAT
StatoFinito
Data di inizio/fine effettiva3/22/103/21/12