La regolazione dell'espressione genica nel riccio di mare P. lividus: il caso dei geni neurali di alfa tubulina

Progetto: Research project

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Lo scopo finale della ricerca proposta è quello di comprendere i meccanismi molecolari che presiedono al network di regolazione dei geni neurali di alfa tubulina del riccio di mare Paracentrotus lividus. Un network regolativo (Levine & Davidson PNAS,102:4936-4942 2005) è fondamentalmente composto da elementi cis-agenti (sequenze in cis presenti nel promotore basale/prossimale ed enhancer) capaci di interpretare ed integrare i segnali, cellulari ed extracellulari, rappresentati essenzialmente dai TFs attivati. Risulta quindi evidente come l'identificazione e la dimostrazione di un ruolo funzionale di specifici elementi cis-agenti sia l'approccio preliminare per la comprensione di un qualunque network regolativo.

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Obiettivi Poichè il transgene utilizzato finora per le microiniezioni (Pl4,5Ta2) ha permesso di dimostrare l'esistenza di elementi di sequenza capaci di dirigere sia la trascrizione basale che di potenziare l'espressione trascrizionale , allo scopo di identificare gli specifici elementi cis agenti coinvolti in questa regolazione, verrà condotta un'analisi di genomica comparata (con il gene ortologo di alfa2 in Strongilocentrotus purpuratus il cui genoma è depositato in banca dati). L'identificazione di eventuali moduli comuni ai "promotori" dei due geni ortologhi servirà per costruire (mediante "delezione" ottenuta con nested PCR) specifici transgeni la cui funzionalità nel dirigere una corretta espressione verrà saggiata mediante microiniezione in embrioni di P.lividus. Inoltre, poichè nel transgene esaminato inizialmente era stato incluso il primo introne del gene alfa 2 (i dati presenti in letteratura per i geni neurali di beta tubulina di uomo e drosophila indicano un coinvolgimento di elementi cis agenti presenti nel primo introne), vogliamo costruire e saggiare un altro transgene privo delle sequenze introniche per dimostrarne un eventuale coinvolgimento nella regolazione trascrizionale del gene alfa2. Negli esperimenti di microiniezione condotti con il transgene Pl4,5Ta2 oltre ad una espressione preferenziale della GFP (reporter utilizzato) nella banda ciliata, si ottiene anche un'espressione ectopica. Poichè l'ipotesi di lavoro prevede un meccanismo di regolazione trascrizionale esplicato da attivatori trascrizionali che inizialmente potenziano l'espressione nei tessuti ectodermici (il neuroectoderma deriva da una “striscia” al confine tra ectoderma orale ed aborale) e dall'azione di repressori trascrizionali che tardivamente reprimono l'espressione nei territori non neurali, è evidente che l'espressione ectopica riscontrata non è coerente con il meccanismo ipotizzato e deve essere quindi spiegata. Due sono le possibili spiegazioni, la prima è addebitabile ad una maggiore stabilità della GFP che “sopravvive” più del trascritto correttamente regolato nei territori "ectopici"; la seconda spiegazione coinvolge un meccanismo di regolazione postrascrizionale, specifico del trascritto di tubulina, che non può operare sul trascritto del transgene poichè quest'ultimo manca degli elementi che conferiscono la specifica stabilità. Esperimenti di ibridazione in situ su embrioni microiniettati, che ci permetteranno di evidenziare la presenza o meno del trascritto “transgenico” nell’ectoderma orale/aborale (il trascritto alfa 2 non è presente), e l’utilizzo di una costruzione transgenica che contenga anche gli elementi capaci di regolare la stabilità dell’mRNA (“prelevati” dal trascritto di tubulina) ci permetteranno di comprendere se esiste anche una regolazione post-trascrizionale. Determineremo infine, studiando la protezione alla DNAsi I del promotore basale, se la regolazione prevede anche una diversa accessibilità del PIC nei diversi stadi embrionali. Metodi -Costruzione (secondo metodiche routinarie) di cloni ricombinati contenenti il gene reporter codificante per GFP posto sotto il controllo di porzioni scalari del presunto promotore del gene PlTalfa2. Le delezioni verranno ottenute mediante PCR utilizzando, di volta in volta, specifici inneschi che presentano all'estremità 5' gli opportuni siti di restrizione. -Microiniezione, nelle uova di P.lividus de-gelificate, delle diverse costruzioni ottenute. Le uova verranno poi fecondate (in alternativa le uova si possono prima fecondare e poi microiniettare) e poste in coltura fino al raggiungimento dello stadio desiderato, nel nostro caso verranno analizzati sia lo stadio di morula (stadio in cui il gene PlTalfa2 non è espresso) che lo stadio di gastrula (stadio in cui il gene PlTalfa2 è espresso). -Analisi statistica (almeno 500/1000 embrioni microiniettati per ogni costruzione) dei territori in cui la GFP viene espressa.
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/07 → …

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