La proteina del retinoblastoma e l’apoptosi indotta dagli inibitori delle deacetilasi istoniche in cellule tumorali in coltura.

Progetto: Research project

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La pRb svolge un ruolo chiave nel controllo di importanti processi cellulari, quali proliferazione, differenziamento e apoptosi. Recentemente è stata identificata in cellule mieloidi una forma tronca di pRb, priva del dominio N-terminale, denominata deltaRB-p70. Risultati preliminari indicano che la deltaRB-p70 è presente anche in cellule di epatoma umano HepG2 e che questa forma incrementa dopo trattamento con il SAHA, un inibitore delle istone deacetilasi in grado di indurre apoptosi in queste cellule.
Nel nostro studio ci proponiamo di identificare il ruolo svolto dalla deltaRB-p70 nelle cellule tumorali.
Il nostro programma di ricerca si propone, innanzitutto, di valutare se la deltaRB-p70 sia presente, oltre che nelle cellule HepG2, anche in altre cellule tumorali in coltura. A tale proposito sarà valutata la presenza della deltaRB-p70 in cellule di epatocarcinoma, carcinoma mammario e del colon retto.
Poiché è stato dimostrato che il livello della deltaRB-p70 decrementa dopo induzione di differenziamento, valuteremo nelle cellule tumorali la variazione nei livelli della deltaRB-p70 dopo trattamento con induttori di differenziamento, quali acido retinoico e fenilbutirrato.
Allo scopo di determinare se la deltaRB-p70 sia correlata con l’apoptosi indotta dagli inibitori delle deacetilasi istoniche, sarà valutato se il trattamento delle cellule tumorali con HDACI si accompagni ad incremento nel livello della deltaRB-p70. Impiegando altri induttori di apoptosi, quali inibitori del proteasoma o delle topoisomerasi, sarà valutato, inoltre, se un eventuale incremento della deltaRB-p70 sia dovuto all’azione specifica degli HDACI o sia una caratteristica comune a tutti gli eventi apoptotici.
Poiché è stato osservato che nelle cellule HepG2 la pRb è presente prevalentemente nello stato fosforilato e che il SAHA è in grado di ridurre il livello di tale forma, sarà valutata la variazione nello stato di fosforilazione di pRb dopo trattamento con diversi HDACI. L’eventuale variazione nel livello di pRb e della sua forma fosforilata sarà paragonata alle variazioni nel livello della deltaRB-p70 dopo induzione dell’apoptosi. Specifici inhibitori di PP1 e PP2A (caliculina A e acido ocadaico) saranno impiegati per accertare se questi enzimi possono essere responsabili della defosforilazione di pRb. Poiché è noto che pRb defosforilata può esser degradata dalle caspasi come conseguenza dell’apoptosi, sarà valutato, inoltre, se il trattamento con inibitori della caspasi prevenga la defosforilazione e la degradazione della pRb indotta dalle HDACI.
Infine, poiché è la mancanza del dominio N-terminale nella deltaRB-p70, potrebbe favorire il rilascio di importanti fattori proapoptotici quali il fattore nucleare p84N5, saranno condotti esperimenti di immunoprecipitazione per valutare le modifiche nella nella composizione degli immunocomplessi di pRb e di deltaRB-p70 dopo induzione di apoptosi.

Layman's description

Il progetto di ricerca si propone di individuare il ruolo svolto dalla deltaRB-p70, una forma tronca derivante da una modifica posttraduzionale della pRb, in cellule tumorali in coltura.
Le ricerche saranno condotte su diverse linee tumorali in coltura utilizzando diversi induttori di apoptosi o di differenziamento.
Gli obiettivi della presente ricerca possono essere così sintetizzati:
1) Valutare la presenza di deltaRB-p70 in diverse linee tumorali in coltura. A tale proposito sarà valutato se la deltaRB-p70 è presente, oltre che nelle cellule di epatoma HepG2, anche in cellule di epatocarcinoma, carcinoma del colon e carcinoma mammario.
2) Valutare se la deltaRB-p70 svolge un ruolo nel differenziamento. Poiché è stato dimostrato che la deltaRB-p70 diminuisce in cellule mieloidi che vanno incontro a differenziamento, sarà valutato se il trattamento delle cellule tumorali con vari agenti differenzianti sia in grado di indurre variazioni nei livelli della deltaRB-p70.
3) Valutare se la deltaRB-p70 svolge un ruolo nell’apoptosi indotta da inibitori delle istone deacetilasi. Risultati preliminari indicano che nelle cellule HepG2 l’inibitore delle deacetilasi istoniche SAHA incrementa i livelli della deltaRB-p70. Saranno pertanto condotti studi per valutare se un incremento del livello della deltaRB-p70 si osserva anche con altri inibitori delle deacetilasi istoniche. Sarà anche valutato l’effetto di altri induttori dell’apoptosi, quali gli inibitori del proteasoma o delle topoisomerasi, al fine di determinare se l’incremento della deltaRB-p70 sia un effetto indotto specificamente dagli HDACI o sia comune ad altri induttori di apoptosi.
4) valutare se l’induzione dell’apoptosi si accompagna a variazioni nel rapporto tra pRb e deltaRB-p70. Risultati preliminari indicano che in cellule HepG2 il SAHA determina, oltre che un incremento della deltaRB-p70, anche una riduzione del livello della forma fosforilata di pRb. Questi studi saranno volti a stabilire se l’apoptosi indotta dagli inibitori delle istone deacetilasi sia correlata con una variazione del rapporto tra pRb e deltaRB-p70. Sarà anche valutato se la defosforilazione di pRb indotta dagli HDACI sia conseguenza dell’attivazione di fosfatasi o dell’attivazione delle caspasi.
5) valutare la variazione nella composizione degli immunocomplessi di deltaRB-p70 dopo induzione di apoptosi. Poiché la deltaRB-p70 è priva del dominio N-terminale, questa forma sarebbe incapace di legare fattori proapoptotici, quali la p84N5, un fattore nucleare coinvolto nell’apoptosi indotta da danno al DNA. L’obiettivo di questi studi è quello di caratterizzare i complessi formati da deltaRB-p70 con proteine apoptotiche e di stabilire se questi complessi vanno incontro a modifiche nella loro composizione in seguito a trattamento con induttori dell’apoptosi.

Metodologie

Gli studi saranno condotti su linee cellulari di epatoblastoma umano HepG2, di epatocarcinoma HuH-6, di carcinoma del colon retto HT29 e di carcinoma mammario MCF7.
Come agenti apoptotici saranno impiegati inibitori delle deacetilasi istoniche, quali SAHA, sodio butirrato, acido valproico, tricostastina o inibitori del proteasoma quali il bortezomib. Come induttori del differenziamento saranno impiegati l’acido retinico e il fenilbuttirrato.
La distribuzione delle cellule lungo le fasi del ciclo cellulare e la percentuale di cellule in apoptosi sarà determinata mediante citometria a flusso dopo colorazione con ioduro di propidio e analizzando i dati mediante il software EXPO32.
Specifici inhibitori di PP1 e PP2A (caliculina A e acido ocadaico) saranno impiegati per accertare se questi enzimi possono essere responsabili della defosforilazione di pRb. Inoltre, inibitori delle caspasi (z-VAD-fmk, z-IEDT-fmk, z-DEVD-CHO) saranno impiegati per valutare il ruolo delle caspasi nella degradazione di pRb.
Il livello di pRb e il suo stato di fosforilazione sarà accertato media
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/06 → …

Fingerprint

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