Isolamento e caratterizzazione di una subpopolazione di cellule con proprietà di cellule staminali cancerose da cellule di osteosarcoma umano

Sintesi del programma di ricerca L’osteosarcoma è il più comune tumore maligno dell’osso altamente mortale perché dopo i trattamenti terapeutici il paziente di solito va incontro a ricadute per le quali l’exeresi rappresenta l’unica via perseguibile. La mancata risposta ai trattamenti suggerisce un’origine del tumore dalla presenza di una rara frazione di cellule con proprietà staminali, resistenti ai farmaci, capaci di infinita autorigenerazione e di differenziamento nei progenitori che danno origine alla complessa ed eterogenea popolazione tumorale. Le cellule staminali potrebbero essere le responsabili delle ricadute, resistenti alla terapia, in pazienti che hanno subito trattamenti terapeutici apparentemente eradicanti. La dimostrazione che lo sviluppo del tumore dipende da un piccolo numero di cellule “stem-like”, potrebbe consentire l’individuazione di nuove strategie antitumorali dirette verso questi nuovi bersagli critici. Nei nostri laboratori cellule di osteosarcoma umano MG-63 sono coltivate da oltre un anno in presenza di 3-AB, un potente inibitore della PARP. Le colture così trattate hanno mostrato progressive modifiche con la formazione di foci sferoidali che ripetutamente staccati e ripiastrati hanno determinato la formazione di una popolazione cellulare abbastanza omogenea e arricchita di elementi cellulari di dimensioni ridotte e di forma rotondeggiante che suggerisce la presenza di una popolazione di potenziali cellule staminali cancerose (MG-63-S). L’obiettivo di questo progetto è l’isolamento e la caratterizzazione della potenziale popolazione con caratteristiche staminali (in grado di autorigenerarsi, di proliferare e di differenziare per dare origine alla complessa ed eterogenea popolazione tumorale). Nella fase iniziale le cellule saranno selezionate e isolate mediante analisi citofluorimetriche (FACS) e tramite sorting magnetico (MACS), sotto la guida di sistemi di riconoscimento di antigeni di staminalità mesenchimale. Quindi sarà valutato se le MG-63-S sortate presentano il fenotipo della “side population” caratterizzato dall’elevata espressione delle proteine della superfamiglia dei trasportatori ABC, che giocano un ruolo chiave nella resistenza ai farmaci chemioterapici. La presenza di elementi cellulari potenzialmente staminali, sarà valutata tramite antigeni di staminalità embrionale e mesenchimale. Al fine di valutare la pluripotenza delle cellule MG-63-S, saranno effettuati saggi di differenziamento osteogenico e adipogenico. Poichè le cellule staminali proliferano lentamente e tendono a staccarsi dal substrato di adesione intendiamo studiare l’espressione di proteine chiave che regolano l’uscita dal ciclo cellulare, in particolare Rb, p53, p15INK4b, p16INK4a, ARF e di proteine responsabili dell’adesione cellula-matrice in particolare quelle della famiglia delle integrine. Le cellule MG-63-S così selezionate e caratterizzate saranno impiegate per valutarne il potenziale tumorigeno attraverso somministrazione sottocutanea a topi SCID.

Obiettivi Nei nostri laboratori cellule di osteosarcoma umano MG-63 sono coltivate da oltre un anno in presenza permanente di 3-AB, un potente inibitore della PARP. Le colture di cellule MG-63 così trattate hanno mostrato progressive modifiche con la formazione di centri di proliferazione dove le cellule tendono a formare ben distinguibili foci sferoidali che sono stati numerose volte manualmente staccati e ripiastrati fino a determinare la formazione di una popolazione cellulare che, per morfologia e proprietà di crescita, suggerisce la presenza di una popolazione di cellule di osteosarcoma staminali cancerose (MG-63-S). In particolare, la popolazione cellulare appare abbastanza omogenea e arricchita di elementi cellulari di dimensioni ridotte e di forma rotondeggiante. Analisi preliminari in citofluorimetria evidenziano che le cellule MG-63-S, rispetto alle cellule MG-63 si distribuiscono, nel doppio plot forward scatter-side scatter, in un ambito molto ristretto, tipico di una popolazione con dimensioni ridotte. L’obiettivo di questo progetto è l’isolamento e la caratterizzazione della potenziale popolazione con caratteristiche staminali (in grado di autorigenerarsi, di proliferare e di differenziare per dare origine alla complessa ed eterogenea popolazione tumorale). Nella fase iniziale le cellule potenzialmente staminali saranno selezionate e isolate mediante analisi citofluorimetriche (FACS) e/o tramite sorting magnetico (MACS), sotto la guida di sistemi di riconoscimento di antigeni di staminalità mesenchimale. Quindi sarà valutato se le MG-63-S selezionate presentano il fenotipo della “side population” caratterizzato dall’elevata espressione delle proteine della superfamiglia dei trasportatori ABC, che giocano un ruolo chiave nella resistenza ai farmaci chemioterapici. Per valutare, se tale popolazione resistente è arricchita di elementi cellulari potenzialmente staminali, sarà valutata la presenza di antigeni di staminalità embrionale e mesenchimale. Al fine di valutare la pluripotenza delle cellule MG-63-S, saranno effettuati saggi di differenziamento, sia osteogenico che adipogenico. Poichè queste cellule, come le cellule staminali, proliferano lentamente e tendono a staccarsi dal substrato di adesione intendiamo studiare l’espressione di proteine chiave che regolano l’uscita dal ciclo cellulare, in particolare Rb, p53, p15INK4b, p16INK4a, ARF e di proteine responsabili dell’adesione cellula-matrice in particolare quelle della famiglia delle integrine. Le cellule MG-63-S così selezionate e caratterizzate saranno impiegate per valutarne il potenziale tumorigeno attraverso somministrazione sottocutanea a topi SCID. Metodologie Cellule impiegate: impiegheremo cellule di osteosarcoma umano MG-63 da noi coltivate da oltre un anno in presenza continua di 3-AB un inibitore della PARP. Isolamento magnetico (MACS) e citofluorimetrico (FACS) delle cellule potenzialmente staminali: per l’isolamento le cellule saranno marcate con anticorpi diretti contro markers mesenchimali staminali: CD105 (endoglina) recettore di membrana per TGF-beta1 e beta2, che modula il segnale da TGF-beta; CD271 (LNGFR, low affinity nerve growth factor receptor). Per il MACS le cellule saranno sortate con microbeads usando un appropriato kit di isolamento (Miltenyi Biotec); per il FACS, le cellule saranno sortate con citofluorimetro. Dopo il sorting la purezza cellulare sarà valutata anche con anticorpi anti Nucleostamina, che avrebbe il ruolo di mantenere la capacità proliferativa delle cellule staminali, e con anticorpi anti Oct3/4 e Nanog, due omeoproteine con il ruolo di mantenere la capacità di autorigenerazione e pluripotenza delle cellule staminali. Studio della side-population: l’espressione dei trasportatori ABC (P-glycoprotein, Mrp1, ABCG2, LRP) si può studiare valutando la velocità di efflusso dalle cellule di molecole lipofiliche quali rodamina 138 e Hoechst 33342 tramite an