Interazioni funzionali tra l’ATPasi stimolata da nucleosomi ISWI e modificazioni covalenti della cromatina

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Le modificazioni della cromatina che avvengono senza cambiamenti nella sequenza di DNA, costituiscono I “markers” epigenetici del nostro genoma. Specifiche combinazioni di modificazioni epigenetiche costituiscono un “codice istonico” che viene decifrato da altre proteine nucleari allo scopo di regolare processi quali la trascrizione o l’organizzazione strutturale dei cromosomii. E’ ormai chiaro che alterazioni nello spettro delle modifiche della cromatina sono alla base di svariate patologie umane. Malgrado l’enorme quantita’ di dati raccolti sui meccanisimi d’azione dei fattori che rimodellano le cromatina e degli enzimi che modificano gli istoni, molto poco sappiamo ancora su come queste attivita’ siano coordinate per regolare processi come l’espressione genica e la struttura della cromatina. Gi studi condotti negli ultimi anni nel nostro gruppo hanno rivelato alcuni dei meccanismi alla base del rimodellamento della cromatina catalizzato da rimodellatore della cromatina ATP dipendente ISWI. Questi studi hanno mostrato che ISWI svolge un ruolo nel compattare la cromatina e nel reprimere la trascrizione. Le nostre ricerche hanno fatto luce sul ruolo e la regolazione in vivo di ISWI ed ampliato le conoscenze sull’interazione funzionale esistente tra complessi di rimodellamento ATP dipendenti e complessi che modificano covalentemente la cromatina . In particolare queste ricerche hanno rivelato che specifiche acetilazioni della cromatina possono influenzare l’abilita’ di ISWI di organizzare la struttura dei cromosomi e regolarne l’espressione genica. L’antagonismo funzionale esistente tra acetilazione degli istoni ed ISWI potrebbe anche spiegare il processo di compensazione del dosaggio in Drosophila. Dato che i maschi di Drosophila hanno un solo cromosoma X, a differenza delle femmine che ne hanno due, il meccanismo di compensazione del dosaggio e’ necessario per l’iper-trascrizione dei geni associati al cromosoma X. L’iper-trascrizione di questi geni potrebbe essere facilitata da un alto livello di acetilazione, antagonizzando cosi l’azione di compattatore/repressore della cromatina esercitata normalmente da ISWI. Date le svariate funzioni che ISWI svolge nel nucleo, e’ probabile che altre modificazioni covalenti degli istoni possano causare dei cambiamenti locali nella cromatina che potrebbero influenzarne l’attivita’ enzimatica. Utilizzando una combinazione di approcci biochimici e genetici ci proponiamo di comprendere se esiste un link funzionale tra la perdita di ISWI ed il processo di compensazione del dosaggio in Drosofila.

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OBIETTIVI L’antagonismo funzional esistente tra l’attivita’ di ISWI e quelle di alcune acetilasi istoniche suggerisce che e’ molto probabile che esistano altre modificazioni covalenti degli istoni che possano causare piccoli cambiamenti nella struttura della cromatina, influenzando l’attivita di rimodellamento della cromatina di ISWI. Con approcci genetici e biochimici, ci proponiamo di identificare e caratterizzare in Drosophila fattori che modificano la cromatina e che possono influenzare l’attivita’ di ISWI, rivelandone un possible ruolo nel meccanismo di compensazione del dosaggio. L’antagonismo funzionale tra l’acetilazione di H4K16 ed ISWI potrebbe infatti spiegare le basi molecolari del processo di compensazione del dosaggio in Drosofila. Una funzione di questo meccanismo potrebbe essere quella di aumentare la trascrizione dei geni nel cromosoma X del maschio acetilando H4K16, antagonizzando cosi il compattamento della cromatina mediato da ISWI, evidenziando l’importanza di studiare e comprendere il ruolo di ISWI in questo processo. Con questo obbiettivo in mente, focalizzeremo la nostra attenzione sui fattori che regolano l’attivita’ di ISWI ed il suo potenziale ruolo nel processo di compensazione del dosaggio. Al fine di raccogliere delle conoscenze di base sui fattori che regolano ISWI, intendiamo dividere la nostra ricerca collaborativa nei seguenti Obbiettivi: 1) Identificazione genetica dei mutanti che regolano l’attivita’ di ISWI in vivo e che potrebbero regolare il meccanismo di compensazione del dosaggio.2) Caratterizzazione a livello biochimico di alcuni dei mutanti in geni che codificano per proteine che potrebbero potenzialmente regolare il meccanismo di compensazione del dosaggio modulando l’attivita’ di ISWI attraverso modificazioni della cromatina. Uno dei vantaggi nell’uso della Drosofila come organismo modello sta’ nell’utilita’ degli strumenti genetici a disposizione. Nuove componenti di specifici processi biologici possono essere identificate attraverso screening genetici. Inoltre, l’analisi molecolare di queste componenti puo’ facilitare la pianificazione di nuovi saggi biochimici in vitro che possono piu’ accuratamente rappresentare un determinato processo biologico. L’insieme degli approcci biochimici e genetici che proponiamo ha un’alta probabilita’ di identificare nuove componenti che regolano l’attivita’ di ISWI. L’analisi genetica ha il vantaggio di tenere conto del potenziale effetto dell’organizzazione strutturale in vivo della cromatina e del contesto fisiologico nucleare in cui avvengono le reazioni di rimodellamento. Tuttavia, l’analisi biochimica potra’ fornirci degli strumenti diretti per testare alcuni dei meccanismi di regolazione di ISWI che potrebbero essere sfuggiti a precedenti analisi. METODi: Di recente abbiamo messo a punto un saggio genetico basato sull’occhio di Drosofila, un organo particolarmente adatto per l’analisi genetica di processi biologici complessi. L’espressione forzata di un gene nei dischi immaginali dell’occhio di Drosofila puo’ alterarne lo sviluppo, compromettendo la distribuzione degli ommatidi o riducendo le dimensioni dell’occhio. Dato che mutazioni nel gene ISWI sono letali in Drosophila, questi fenotipi nell’occhio possono essere utilizzati come base per uno screening genetico senza compromettere la vitalita’ e la fertilita’ dei mutanti isolati. Una singola sostituzione aminoacidica in ISWI, K159R, elimina l’attivita’ ATPasica ma non compromette l’abilita’ della proteina mutante di essere incorporata in complessi nativi, generando cosi una mutazione dominante negativa. L’espressione di ISWIK159R nell’occhio, ha un effetto molto forte sulla sopravvivenza cellulare e genera insetti con occhi compromessi o molto ridotti. Questo saggio dell'occhio e’ stato impiegato come base per uno screen genetico assumendo che altre mutazioni in ge
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/07 → …

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