Interazioni funzionali tra l'ATPasi stimolata da nucleosomi ISWI e modificazioni covalenti della cromatina nel processo di compensazione del dosaggio in Drosofila

Progetto: Research project

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Le modificazioni della cromatina che avvengono senza cambiamenti nella sequenza di DNA, costituiscono I “markers” epigenetici del nostro genoma. Specifiche combinazioni di modificazioni epigenetiche costituiscono un “codice istonico” che viene decifrato da altre proteine nucleari allo scopo di regolare processi quali la trascrizione o l’organizzazione strutturale dei cromosomi (1,2). E’ ormai chiaro che alterazioni nello spettro delle modifiche della cromatina sono alla base di svariate patologie umane (3). Malgrado l’enorme quantita’ di dati raccolti sui meccanisimi d’azione dei fattori che rimodellano le cromatina e degli enzimi che modificano gli istoni, molto poco sappiamo ancora su come queste attivita’ siano coordinate per regolare processi come l’espressione genica e la struttura della cromatina. Ho iniziato ad interessarmi di dinamica della cromatina durante I miei studi di dottorato presso il laboratorio del Dr.Becker all’EMBL di Heidelberg (Germania), dove ho caratterizzato CHRAC, un complesso multiproteico di Drosofila che rimodella la cromatina, utilizzando l’energia di idrolisi dell’ATP per traslocare i nucleosomi e favorire la “fluidita’” della cromatina. Queste ricerche hanno contribuito alla caratterizzazione biochimica di CHRAC ed hanno rivelato alcuni dei meccanismi alla base del rimodellamento della cromatina catalizzato da ISWI (4-9).Per complementare la mia formazione in campo biochimico, ho deciso di svolgere il periodo di postdottorato nel laboratorio del Dr.Tamkun presso UCSC (USA), per apprendere tecniche di genetica molecolare applicate allo studio della dinamica della cromatina. Questi studi hanno mostrato che ISWI svolge un ruolo nel compattare la cromatina e nel reprimere la trascrizione (12). Le mie ricerche hanno rivelato che specifiche acetilazioni della cromatina possono influenzare l’abilita’ di ISWI di organizzare la struttura dei cromosomi e regolarne l’espressione genica (11,13). Queste ricerche hanno fatto luce sul ruolo e la regolazione in vivo di ISWI ed ampliato le conoscenze sull’interazione funzionale esistente tra complessi di rimodellamento ATP dipendenti e complessi che modificano covalentemente la cromatina (10-15).L’antagonismo funzionale esistente tra acetilazione degli istoni ed ISWI potrebbe anche spiegare il processo di compensazione del dosaggio in Drosophila. Dato che i maschi di Drosophila hanno un solo cromosoma X, a differenza delle femmine che ne hanno due, il meccanismo di compensazione del dosaggio e’ necessario per l’iper-trascrizione dei geni associati al cromosoma X (21). L’iper-trascrizione di questi geni potrebbe essere facilitata da un alto livello di acetilazione, antagonizzando cosi l’azione di compattatore/repressore della cromatina esercitata normalmente da ISWI.Date le svariate funzioni che ISWI svolge nel nucleo (12), e’ probabile che altre modificazioni covalenti degli istoni possano causare dei cambiamenti locali nella cromatina che potrebbero influenzarne l’attivita’ enzimatica. Nel mio laboratorio, finanziato dalla Giovanni Armenise Harvard Foundation e da Telethon, sto’ caratterizzando fattori che modificano la cromatina e che regolano l’attivita’ di ISWI. A tal scopo sto utilizzando una combinazione di approcci biochimici e genetici per comprendere come I processi di rimodellamento della cromatina ATP dipendenti sono regolati ed integrati nel piu’ ampio network di modificazioni postraduzionali della cromatina. Sono convinto che il supporto che potremmo ricevere dal FIRB, in questo progetto di cooperazione scientifica tra Italia ed USA, sarebbe di vitale

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OBIETTIVI:L’ATPasi ISWI, estremamente conservata negli eucarioti, e’ presente in diversi complessi che rimodellano la cromatina rendendola altamente dinamica. I complessi contenenti ISWI sono stati implicati nel controllo dalla trascrizione, nell’organizzazione dei cromosomi e nella replicazione del DNA (12). Tuttavia, si sa ancora poco su come ISWI venga regolata, indirizzata a svolgere questi processi biologici e sopratutto come la sua attivita’ sia integrata nel complesso network di modificazioni covalenti della cromatina.La parziale perdita di funzione di ISWI altera drasticamente l’architettura strutturale del cromosoma X nei maschi di Drosophila, causandone l’apparente decondensazione.(16; Fig1A). Durante il mio postdottorato ho trovato che mutazioni dominanti negative in ISWI, determinano la decondensazione dei cromosomi sessuali e degli autosomi sia nel maschio che nella femmina (13, Fig1A). Questi dati suggeriscono che ISWI in vivo svolge una funzione molto generale nell’organizzare i livelli superiori di struttura della cromatina.I difetti cromosomali osservati nei mutanti ISWI maschi indicano che qualche caratteristica del cromosoma X li rende particolarmente sensibili alla perdita parziale della funzione di ISWI. Nei maschi di Drosofila la trascrizione dei geni nel cromosoma X e’ aumentata di circa due volte rispetto alle femmine grazie ai meccanismi di compensazione del dosaggio, un processo che comporta l’acetilazione sito specifica dell’istone H4 in lisina 16 (H4K16) da parte dell’acetiltransferasi MOF (21). Dato che l’istone H4 e’ necessario e sufficiente per stimolare l’attivita’ di ISWI (9), ho ipotizzato che l’acetilazione globale di H4K16 nel cromosoma X dei maschi poteva direttamente antagonizzare la capacita’ di ISWI di compattare la cromatina.Per testare questa ipotesi, ho condotto test di epistassi e monitorato eventuali interazioni genetiche tra ISWI e l’acetilazione in H4K16. Questi studi hanno mostrato che in un mutante ISWI bloccando l’acetilazione in H4K16 nel cromosoma X dei maschi, ottenevo una soppressione della decondensazione del cromosoma X (11). Al contrario, l’acetilazione forzata di H4K16 nel cromosoma X delle femmine (normalmente non acetilato) ne alterava drammaticamente la struttura, in modo simile ai mutanti ISWI maschi (11). In conclusione, l’acetilazione di H4K16 e’ necessario e sufficiente per spiegare la decondensazione del cromosoma X osservato nei maschi mutati in ISWI (11). Inoltre,da saggi di competizione dell’attivita’ ATPasica di ISWI stimolata da nucleosoma abbiamo dedotto che l’acetilazione di H4K16 puo’ direttamente inibire l’interazione fisica tra l’istone H4 ed ISWI in vitro (11). Questi dati suggeriscono che ISWI e’ in grado di “sentire” modificazioni distinte della cromatina e di rispondere a queste di conseguenza.Questi studi in vivo ed in vitro suggeriscono che l’acetilazione di H4K16 antagonizza l’azione di compattamento della cromatina mediata dalla ATPasi ISWI. Questo risultato indica che e’ molto probabile che esistano altre modificazioni covalenti degli istoni che possano causare piccoli cambiamenti nella struttura della cromatina che sarebbero probabilmente difficili da rilevare citologicamente in cromosomi di mutanti ISWI. L’abilita’ di ISWI di “sentire” distinte modificazioni covalenti della cromatina indica che queste possono influenzare la sua attivita’. Con approcci biochimici e genetici in Drosofila, ci proponiamo di identificare e caratterizzare fattori che modificano la cromatina e che possono influenzare l’attivita’ di ISWI, rivelandone un possible ruol
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/05 → …