Influenza del microambiente sull'espressione genica del carcinoma mammario.

    Progetto: Research project

    Dettagli progetto

    Description

    Il carcinoma mammario è ancora una delle principali cause di morte per tumore tra le donne in tutti i paesi industrializzati. La mortalità è causata dalle devastanti conseguenze della frequente insorgenza di metastasi in siti distanti dal tumore primario, anche dopo lunghi periodi di latenza.Come altri carcinomi, esso si sviluppa da cellule epiteliali attraverso l'accumulo sequenziale di alterazioni geniche multiple. Per molti anni numerose ricerche sono state rivolte all'identificazione di possibili determinanti genetici responsabili della progressione metastatica. Gli attuali indirizzi di ricerca suggeriscono piuttosto, che il fenotipo invasivo, anziché predeterminato, sia l'espressione di modulazioni epigenetiche indotte da fattori microambientali sulle cellule inizialmente trasformate. Il processo metastatico si avvia potenzialmente nel momento in cui le cellule neoplastiche oltrepassano la lamina basale ed entrano in contatto con lo stroma dell'ospite, composto da matrice extracellulare (ECM) e da una varietà di cellule residenti, migranti ed infiltranti, potenziali produttrici di fattori bioattivi. E' verosimile che nella fase di progressione si instaurino complesse interazioni paracrine, che coinvolgono lo scambio di molecole informazionali tumore/ospite. Teoricamente ogni componente cellulare può inviare e ricevere segnali da tutti gli altri, e una volta attivato, ogni tipo cellulare può modulare le risposte e modificare il repertorio dei segnali. In ultimo, l'orchestrazione collettiva di questi interscambi può avere effetti permissivi o restrittivi sui processi angiogenetici e sulla propensione delle cellule neoplastiche a formare metastasi. Obiettivo del presente progetto è lo studio delle possibili influenze esercitate da fattori del microambiente sull'espressione genica del carcinoma mammario. Utilizzando un sistema in vitro di cellule di carcinoma mammario, in precedenza caratterizzate dal punto di vista genomico e fenotipco, si realizzeranno condizioni sperimentali, ricostitute in vitro, tali da simulare alcune delle situazioni che si verificano in vivo durante la progressione tumorale. Saranno separatamente studiati gli effetti esercitati rispettivamente da fibroblasti, macrofagi e cellule endoteliali (che figurano tra i tipi cellulari più rappresentati nel contesto tumorale della mammella) sulle cellule di carcinoma mammario. Poiché non è prevedible il numero di geni/preteine coinvolti in queste interazioni, si applicherà la strategia della proteomica abbinata alla genomica, che consente di valutare su ampia scala la modulazione dell'espressione di geni e proteine indotta sulle cellule opportunamente trattate. Nel nostro laboratorio sono disponibili attrezzature e competenze per tali analisi (v.pubb.Pucci-Minafra et al.2002-2006) ed inoltre sono stati già standardizzati i sistemi di co-coltura tra cellule di carcinoma mammario e fibroblasti.

    Layman's description

    Il microambiente tumorale è composto da una matrice extracellulare in cui coesistono cellule neoplastiche, fibroblasti, cellule della risposta immunitaria e cellule endoteliali. Ciascun componente del microambiente può interagire con gli altri, ed in ultima analisi con le cellule endoteliali, regolando l'angiogenesi, un evento critico durante la progressione tumorale. Similmente, le cellule neoplastiche possono essere modulate o soggette a selezione clonale, attraverso segnali del microambiente che possono determinare il loro destino cellulare in termini di sopravvivenza, proliferazione, apoptosi o formazione di metastasi. Numerose evidenze sperimentali indicano come nell'ambiente tumorale si verifichi un reclutamento di fibroblasti e macrofagi. Per esempio si è osservato che la densità dei macrofagi aumenta nel sito del tumore e che gli stessi sono in grado di produrre potenti fattori di stimolazione diretti alle cellule neoplastiche, incluse le mammarie, alle cellule endoteliali ed ai fibroblasti. Similmente, i fibroblasti attivati possono produrre un vasto repertorio di fattori pleiotropici, tutti potenzialmente attivi sulle cellule neoplastiche e/o su altre cellule mesenchimali. Inoltre, i fibroblasti sono responsabili della sintesi e del rimodellamento della ECM, attraverso il rilascio di proteasi di matrice. A causa della grande complessità di questa rete all'interno del microambiente tumorale, l'obiettivo del progetto è quello di "dissezionare" singolarmente alcuni punti nodali delle interazioni tra cellule neoplastiche e microamabiente, privilegiando in prima istanza lo studio degli effetti indotti da collageni diversi sulla popolazione cellulare ed in secondo luogo l'effetto di fattori solubili rilasciati da cellule mesenchimali (fibroblsti, macrofagi, cellule endoteliali). Si applicherà la strategia proteomica abbinata alla genomica, che consente di valutare su ampia scala la modulazione genica indotta sulle cellule opportunamente stimolate. Nel nostro laboratorio sono disponibili attrezzature e competenze per l'analisi proteomica e genomica (v.pubb.Pucci-Minafra et al.2002-2006) ed inoltre sono stati già standardizzati i sistemi di co-coltura tra cellule di carcinoma mammario e fibroblasti. I risultati di queste ricerche possono fornire un contributo rilevante sui meccanismi epigenetici alla base della formazione di metstastasi e possono fornire indicazioni su candidati marcatori di malignità del carcinoma mammario. Metodologie Le metodologie da utilizzare sono tutte ampiamente standardizzate e collaudate nel nostro laboratorio. Le principali riguardano: 1. Colture cellulari: 1.1. Semina delle cellule su: fiasche in plastica, chamber slides, pozzetti mltiwell, in presenza o in assenza di substrati ricostituti. 1.2. Saggi di proliferazione cellulare: metodo colorimetrico MTS 1.3. Immunocitochimica su cellule in monostrato seminate sulle chamber slides. 1.4. Saggi di invasività e chemiotassi con le camere di Boyden. 2. Analisi proteomica: 2.2. 2D-IPG e tecniche correlate 2.3. Analisi di immagine 2.4. Analisi statistiche 2.5. Sequenziamento delle proteine N-terminale 2.6. Sequenziamento delle proteine mediante Maldi-Toff 3. Analisi zimografiche 4. Analisi dei trascritti mediante RT-PCR e Microarray
    StatoAttivo
    Data di inizio/fine effettiva1/1/06 → …

    Fingerprint

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