Induzione di apoptosi in cellule di epatoblastoma umano HepG2. Azione sinergica del SAHA e del bortezomib; ruolo della via estrinseca dell’apoptosi e di Bcl-Xs.

    Progetto: Research project

    Dettagli progetto

    Description

    Studi precedentemente condotti nei nostri laboratori hanno dimostrato che sia gli inibitori del proteasoma che gli inibitori delle deacetilasi istoniche esercitano una marcata azione apoptotica in cellule di epatoblastoma umano HepG2 in coltura, mentre risultano inefficaci in cellule epatiche non tumorali Chang liver. I nostri studi hanno anche permesso di accertare il meccanismo attraverso il quale questi composti inducono apoptosi. In particolare, l’inibitore del proteasoma bortezomib induce la stabilizzazione di numerosi fattori coinvolti nell’apoptosi ed incrementa l’attività sia del fattore di trascrizione AP-1 che di JNK. L’inibitore delle deacetilasi istoniche SAHA incrementa il livello di molti fattori mitocondriali correlati con l’apoptosi. Entrambi i composti sono, inoltre, in grado di attivare la via estrinseca dell’apoptosi. Numerosi dati acquisiti di recente indicano che bortezomib e SAHA, quando impiegati in associazione, sono in grado di indurre apoptosi in modo sinergico e che tale effetto si osserva solo nelle cellule tumorali. Ciò consente di ottenere effetti marcati riducendo di molto le dosi dei singoli composti impiegati. Il nostro studio si propone di individuare il meccanismo responsabile dell’interazione sinergica tra bortezomib e SAHA. In particolare abbiamo in programma di valutare: 1) Il possibile effetto sinergico del SAHA e del bortezomib sull’attivazione di fattori coinvolti nella via estrinseca dell’apoptosi (FASL, FASR, Caspasi-8, Bid, caspasi-3). Valuteremo il livello delle proteine mediante analisi di western blotting e il livello dei corrispondenti mRNA mediante RT-PCR. Gli effetti saranno valutati associando i composti a concentrazioni tanto basse da risultare del tutto inefficaci quando somministrati da soli. Riteniamo che un possibile effetto sinergico possa derivare da un’azione del SAHA sul rilassamento della cromatina e da un contemporaneo effetto del bortezomib sull’ espressione genica mediata da AP-1. 2) Per accertare l’importanza della via estrinseca intendiamo inibire la caspasi-8 con lo specifico inibitore IEDT e l’attività di AP-1 mediante la curcumina, inibitore del binding di AP-1 al DNA. 3) Studieremo gli effetti di deboli concentrazioni di SAHA e di bortezomib sull’espressione delle isoforme di Bcl-X (Bcl-Xs e Bcl-XL), con lo scopo di individuare un possibile effetto sinergico concernente l’isoforma Bcl-Xs. 4) Cercheremo di spiegare le modalità attraverso le quali il SAHA da solo o in associazione con il bortezomib può indurre l’espressione di Bcl-xs. A tale proposito valuteremo la possibile interazione tra SAHA e HDAC; l’attivazione di fosfatasi quali PP1 e PTEN; l’interazione delle fosfatasi con le proteine SR; la defosforilazione delle SR come causa di una variazione del meccanismo di splicing. Gli studi saranno condotti tramite western blotting, RT-PCR, tecniche di immunoprecipitazione e saggi elisa per la valutazione delle attività delle fosfatasi.

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    Obiettivi Il progetto di ricerca intende valutare i meccanismi molecolari alla base dell’effetto sinergico tra l’inibitore delle deacetilasi istoniche SAHA e l’inibitore del proteasoma bortezomib in cellule di epatoblastoma umano HepG2. In particolare, si intende accertare se il sinergismo dipende dall’attivazione del pathway estrinseco dell’apoptosi con particolare attenzione al ruolo svolto da FasL. Si intende, inoltre valutare il ruolo esercitato da Bcl-Xs, l’isoforma pro-apoptotica derivata da splicing alternativo del gene Bcl-X, e le modalità mediante le quali i meccanismi di splicing possono essere modulati in risposta al trattamento combinato. Metodologie Il modello sperimentale impiegato è rappresentato da cellule di epatoblastoma umano HepG2, ed per alcune valutazioni sarà impiegata la linea di cellule epatiche non tumorali Chang liver. Saranno impiegati come induttori di morte l’inibitore del proteasoma bortezomib e l’ inibitore delle istone deacetilasi SAHA. I due composti saranno impiegati concentrazioni sub-tossiche tali da esplicare un effetto sinergico quando somministrati in combinazione. La vitalità cellulare sarà valutata mediante il saggio colorimetrico che impiega il 3-(4,5-dimetiltiazol-2-lil-2,5 difeniltetrazodiobromuro) (MTT), un composto che viene ridotto dalle deidrogenasi mitocondriali, producendo un cromogeno la cui concentrazione è direttamente proporzionale al numero di cellule vive. L’apoptosi sarà valutata mediante analisi morfologica al microscopio a fluorescenza, dopo colorazione con acridina orange/etidio bromuro. La distribuzione delle cellule lungo le fasi del ciclo e la percentuale di cellule che presentano frammentazione del DNA tipica dell’apoptosi sarà determinata mediante citoflurimetria dopo colorazione con ioduro di propidio. I dati saranno analizzati mediante il software EXPO32. Il livello delle proteine coinvolte nell’apoptosi sarà valutato con tecniche di western blotting, utilizzando specifici anticorpi. Identiche quantità di proteine saranno sottoposte ad elettroforesi in gel di poliacrilammide in presenza di SDS, trasferite su filtro di nitrocellulosa mediante elettroblotting. Le bande vengono identificate mediante impiego di anticorpi specifici. L’analisi densitometrica dell’intensità delle bande sarà eseguita mediante IMAGE SXM 1.62 Software. L’espressione di geni correlati con l’induzione del processo apoptotico sarà analizzata mediante RT-PCR. La presenza di complessi proteici sarà evidenziata mediante tecniche di immunoprecipitazione che impiegano specifici anticorpi. Dopo estrazione e purificazione del RNA cellulare, si procederà alla retrotrascrizione degli mRNAs in presenza di trascrittasi inversa e successiva amplificazione del retrotrascritto mediante PCR. Impiegando specifici sets di primers saranno accertate eventuali variazioni nel livello di espressione di alcuni fattori coinvolti nell’apoptosi ed i risultati saranno comparati a quelli ottenuti valutando i geni controllo (GAPDH, beta-actina). L’intensità delle bande sarà quantificata mediante l’impiego di un programma di analisi densitometrica (IMAGE SXM 1.62 Software). Esperimenti di gel-shift permetteranno di studiare la capacità di binding al DNA di AP-1. A questo proposito estratti nucleari di cellule trattate con bortezomib o SAHA saranno incubati in presenza di oligonucleotidi marcati con 32[P], contenenti la sequenza consensus per AP-1. I complessi DNA-proteine saranno sottoposti ad elettroforesi su gel di policrilamide e visualizzati per autoradiografia.
    StatoAttivo
    Data di inizio/fine effettiva1/1/05 → …

    Fingerprint

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