INDUZIONE DI APOPTOSI IN CELLULE DI CARCINOMA COLORETTALE UMANO HT29

Progetto: Research project

Dettagli progetto

Description

Questo progetto si propone di individuare composti in grado di indurre morte nelle cellule di carcinoma umano HT29, in coltura. Intendiamo saggiare l’attività citotossica di numerose sostanze già impiegate per il trattamento di altre forme tumorali, tra cui inibitori delle topoisomerasi, inibitori del proteasoma, analoghi delle basi azotate, inibitori delle deacetilasi istoniche, endocannabinoidi ecc. Individuati i composti più attivi, valuteremo, mediante microscopia a fluorescenza e tecniche citofluorimetriche, se gli effetti citotossici sono da imputare al processo apoptotico. Successivamente studieremo i meccanismi biochimici attraverso i quali questo processo si realizza. Esperimenti di western blotting verranno eseguiti per valutare il coinvolgimento dei recettori di morte e dei rispettivi ligandi, delle caspasi, dei membri della famiglia di Bcl-2 e di altri fattori che notoriamente intervengono in tale processo. Analisi di proteomica, eseguite su estratti ottenuti da cellule trattate, potrà fornirci ulteriori informazioni circa altri fattori implicati nel programma di morte. Poiché abbiamo già dimostrato che, in altri modelli sperimentali, il trattamento con droghe proapototiche può determinare l’attivazione di fattori di sopravvivenza cellulare, ci proponiamo, inoltre, di individuare tali fattori al fine di trovare strategie in grado di inattivarli e quindi potenziare gli effetti citotossici indotti. Esperimenti preliminari hanno già dimostrato che l’inibitore delle deacetilasi istoniche SAHA è particolarmente efficace nell’indurre morte nelle cellule HT29, pertanto, in una fase iniziale, gli studi saranno volti ad chiarire il percorso apoptotico indotto da questo composto. A tal fine, poiché è stato riportato in altri sistemi sperimentali che il SAHA è in grado di indurre apoptosi attraverso stress ossidativo, valuteremo nelle nostre cellule l’eventuale produzione di ROS servendoci di una tecnica citofluorimetrica recentemente messa a punto nel nostro laboratorio. Nel caso questo evento si realizzasse, cercheremo di capire quali sistemi enzimatici sono responsabili della produzione delle specie reattive dell’ossigeno e quali fattori di morte sono attivati dallo stress ossidativo. Infine, ci proponiamo di effettuare esperimenti di associazione nel tentativo di trovare combinazioni di composti in grado di esercitare effetti sinergici pur utilizzando concentrazioni non tossiche delle singole droghe.

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Obiettivi Gli obiettivi principali che questo progetto si propone sono: - Individuare composti in grado di indurre apoptosi in cellule di carcinoma colorettale umano HT29. A tal fine sarà valutata l’attività citotossica di numerosi composti che sono già stati indicati come possibili induttori di morte in cellule tumorali. - Chiarire i meccanismi biochimici attraverso i quali il processo apoptotico viene indotto. Per il raggiungimento di tale obiettivo verrà studiata l’espressione e/o l’eventuale attivazione di numerosi fattori notoriamente coinvolti nel processo apoptotico. - Evidenziare eventuali sistemi di difesa che le cellule trattate mettono in atto e cercare di inattivarli. E’ noto che molti tumori si mostrano resistenti al trattamento con i chemioterapici. Questa resistenza può dipendere da vari meccanismi di protezione che le cellule trattate attivano. Tra questi fattori un ruolo preminente viene svolto dalle proteine da shock termico (HSPs), da alcuni membri della famiglia di Bcl-2, dal fattore di trascrizione NFkB, dalla proteina Akt, dalla survivina e da altri ancora. L’individuazione di questi fattori, eventualmente attivati in seguito al trattamento, può essere molto utile per spiegare il mancato o lo scarso effetto di una sostanza e per cercare strategie in grado di inattivarli. - Trovare combinazioni di composti in grado di esercitare effetti sinergici. Nella terapia dei tumori, l’uso di più farmaci in associazione è ormai diventata una prassi consolidata. La combinazione di composti diversi che inducono morte attraverso differenti meccanismi, risulta molto vantaggiosa perché da una parte si possono ottenere effetti sinergici, e dall’altra si possono ridurre gli effetti collaterali dal momento che vengono ridotte le dosi dei singoli composti. Metodologie Il sistema sperimentale utilizzato per la realizzazione del presente progetto è costituito dalle cellule di carcinoma umano HT29, in coltura. Le cellule saranno trattate per tempi variabili con varie droghe apoptotiche. Gli effetti citotossici saranno studiati sia attraverso la colorazione delle cellule con trypan blue che mediante il test dello MTT. La microscopia a fluorescenza, dopo colorazione delle cellule con opportuni fluorocromi (Hoechst, arancio di acridina- bromuro di etidio) ci darà informazioni sul tipo di morte indotta. Verranno eseguiti anche saggi citofluorimetrici per discriminare quantitativamente la frazione di cellule vitali da quelle con DNA frammentato. Lo studio dell’apoptosi verrà effettuato con l’impiego dell’Annexina V, una proteina che lega la fosfatidilserina, un fosfolipide che trasloca dalla parte interna della membrana a quella esterna nelle fasi iniziali dell’evento apoptotico. In particolare l’impiego di Annexina V-FITC permetterà di evidenziare le cellule in apoptosi precoce e distinguerle da quelle già in tarda apoptosi o in necrosi. Saggi colorimetrici che utilizzano specifici substrati coniugati con paranitroanilina (DEVD-pNA,YVAD-pNA, ecc.) saranno impiegati per accertare la capacità degli induttori di morte nel promuovere l’attività delle caspasi. Mediante esperimenti di western blotting accerteremo se l’esposizione alle droghe è in grado di modificare il livello di proteine con attività pro o antiapoptotica. Eventuali variazioni della espressione genica delle proteine coinvolte negli eventi apoptotici verranno valutate mediante real time-PCR. Analisi di proteomica, eseguita tramite elettroforesi bidimensionale, potrà fornirci ulteriori informazioni circa altri fattori implicati nel programma di morte. L’eventuale produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) sarà studiata tramite un saggio citofluorimetrico che vede l’impiego del H2DCFDA, un composto che penetra nelle cellule e, dopo deacetilazione, viene ossidato dai ROS divenendo fluorescente. Eventuali effetti sinergici tra composti diversi sarà
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/06 → …

Fingerprint

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