IMPIEGO DI CELLULE UMANE STAMINALI CANCEROSE 3AB-OS COME MEZZO PER STUDIARE LE FUNZIONI DELLE CELLULE STAMINALI E PER PRODURRE NUOVE APPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE

La conoscenza dei meccanismi che governano lo sviluppo e la funzione delle cellule staminali è una delle maggiori aspettative della società moderna grazie alle conquiste che tali conoscenze potrebbero apportare alla ricerca di base, applicata e clinica. Le cellule staminali tumorali possono rappresentare un utile strumento che può soddisfare molte aspettative. La conoscenza delle cellule staminali tumorali ha implicazioni fondamentali per lo studio della biologia del cancro, oltre che per le implicazioni cliniche come la valutazione di rischio, diagnosi precoce, prognosi, prevenzione e terapia della malattia cancerosa. Abbiamo recentemente prodotto e brevettato una nuova linea cellulare tumorale staminali (3AB-OS) che è stata selezionata da cellule di osteosarcoma umano MG-63. Con tali cellule intendiamo: A. 1.Valutare la pluripotenzialità delle 3AB-OS studiando la capacità di produrre derivati dei tre foglietti germinali. 2. Valutare, sia in vivo che in vitro il loro potenziale invasivo, metastatico e proliferativo. A tale scopo per la valutazione della capacità tumorigenica delle cellule MG-63 e 3AB-OS saranno effettuati esperimenti in vitro mediante saggio di invasività in Matrigel; per le valutazioni in vivo, sia le cellule 3AB-OS che le MG-63 saranno iniettate sottocute in topi nudi; inoltre le cellule 3AB-OS, trasfettate stabilmente con green fluorescent protein (GFP), saranno iniettate in topi nudi allo scopo di valutarne la distribuzione B. Analizzare i complessi eventi regolativi assieme alla natura dei segnali che mantengono la stabilità delle cellule 3AB-OS. In particolare intendiamo: 1. Identificare markers caratteristici della linea 3AB-OS in comparazione con le cellule di osteosarcoma umano MG-63. 2. Valutare la capacità proliferativa delle cellule 3AB-OS analizzando l'espressione, l'attività e la localizzazione delle proteine che controllano il ciclo cellulare, correlando questi dati con i pathways di trasduzione di segnali proliferativi 3. Valutare l'influenza della deprivazione nutrizionale (glucoso e glutammina) e dell'ipossia sulla proliferazione e sulle attività metaboliche delle cellule 3AB-OS. C. Effettuare analisi multiparametriche mediante citofluorimetria di marcatori di superficie cellulare nelle cellule 3AB-OS allo scopo di rendere disponibili e riproducibili biomarcatori molecolari utili all'identificazione di cellule staminali cancerose, che saranno utili per la diagnosi precoce, prognosi e monitoraggio di terapie tumorali. Questa ampia caratterizzazione multidimensionale sarà utile a determinare la gerarchia di discrete sottopopolazioni che compongono la linea cellulare 3AB-OS, il loro livello di de-differenziamento, il loro potenziale clonogenico e la loro tumorigenicità espressa in vivo. In particolare, effettueremo: 1. caratterizzazione di proteine di membrana in cellule 3B-OS 2. Valutazione dei livelli di ALDH e correlazione tra ALDH e fenotipo di superficie 3. Correlazione tra capacità di efflusso di Hoechst 33342 e fenotipo di superficie cellulare. 4. Separazione mediante cell sorting di sottopopolazioni di cellule 3AB-OS 5. Test funzionali per la valutazione delle capacità invasive, livello di maturazione, pluripotenza, capacità rigenerativa delle cellule isolate 6. Analisi del proteoma di sottopopolazioni di cellule 3AB-OS 7. Induzione di tumori in vivo utilizzando sottopopolazioni di cellule 3AB-OS D. Analizzare in comparazione linee cellulari di osteosarcoma MG-63, cellule tumorali estratte da pazienti e cellule 3AB-OS. Intendiamo: 1. analizzare l'espressione di geni coinvolti nelle fasi proliferative dei pre-osteoblasti2. stabilire il loro ruolo nella tumorigenesi; 3. comprendere il ruolo dei geni sovra-espressi nell'osteosarcoma inibendone l'espressione mediante shRNA. 4. mirare a possibili effetti terapeutici di specifici inibitori dei prodotti dei geni identificati. Ciò permetterà anche lo sviluppo di n