Il riccio di mare come modello sperimentale: regolazione dei geni neurali e risposta allo stress

Progetto: Research project

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Il riccio di mare Paracentrotus lividus risulta essere un modello ottimale per lo studio dei meccanismi molecolari alla base dello sviluppo embrionale, delle reti di regolazione e specificazione del destino cellulare e dei pathways di risposta ai vari tipi di stress. Uno dei circuiti di regolazione genica attivati durante lo sviluppo dell’embrione di P. lividus, porta alla specificazione delle cellule nervose dell’embrione in cui verrà attivata la trascrizione dei geni tipicamente neurali. Fra questi geni vi sono quelli che codificano per dei particolari isotipi di alfa e beta tubulina, che sono stati da noi isolati e di cui è stata studiata la regolazione temporale e spaziale. In questo progetto ci proponiamo di continuare lo studio della regolazione trascrizionale dei geni che codificano per le tubuline, in particolare del gene alfa2. Precedenti esperimenti di gene transfer ci hanno consentito di individuare i confini della regione di regolazione necessaria per la corretta espressione genica, ed inoltre, applicazioni bioinformatiche quali ad es. il footprinting filogenetico, hanno dato preziose indicazioni circa la presenza di putativi siti di legame per fattori trascrizionali. Con questo progetto intendiamo continuare e rifinire lo studio della regolazione trascrizionale di questo gene, utilizzando metodiche di gene transfer, microiniettando nelle uova di riccio di mare costruzioni sintetiche contenenti frammenti diversi della regione di regolazione posti a monte di geni reporter quali GFP (per ottenere dati di tipo qualitativo) e LUC (per ottenere dati di tipo quantitativo). Una volta identificati i moduli regolativi, intendiamo procedere con l’analisi dell’espressione di costruzioni contenenti mutazioni sito specifiche per valutare, mediante saggi funzionali di microiniezione in uova di riccio di mare, il reale coinvolgimento di ciascuno di essi nella regolazione dell’espressione del gene alfa2. E’ noto anche che l’embrione di riccio di mare risponde a diversi tipi di stress ambientale attuando delle risposte, spesso di tipo autofagico o apoptotico, che ne consentano la sopravvivenza. In particolare l’esposizione al cadmio provoca ritardi e anomalie dello sviluppo, autofagia, e apoptosi e, a livello molecolare la produzione di alcune HSP, l’attivazione della p38-MAPK, nonché di LC3 e caspasi. Non si conoscono però i meccanismi e le vie di trasduzione che portano a queste risposte. Per studiare a livello molecolare i meccanismi di risposta precoce all’esposizione al cadmio, effettueremo esperimenti di ibridazione sottrattiva soppressiva (SSH) che ci consentiranno di costruire due genoteche di cDNA contenenti cloni che codificano per proteine differenzialmente espresse negli embrioni trattati rispetto ai controlli. Dall’analisi delle sequenze ottenute, potremo avere un quadro della variazione del trascrittoma degli embrioni in seguito ad un’esposizione non letale al metallo. I risultati dell’ibridazione sottrattiva verranno validati con esperimenti di RT-qPCR effettuati sugli stessi RNA utilizzati per l’ibridazione sottrattiva. Inoltre, valuteremo la quantità dei diversi trascritti in embrioni di P. lividus trattati e non trattati con diverse concentrazioni di cadmio, utilizzando la metodica dell’RT-qPCR. Una volta ottenuto un panorama della induzione trascrizionale dovuta al cadmio in maniera dose dipendente, passeremo allo studio della espressione spaziale di alcuni dei trascritti più interessanti, rilevandone l’eventuale differente espressione nei diversi territori embrionali. A questo scopo effettueremo esperimenti di ibridazione in situ su embrioni interi utilizzando sonde marcate con digossigenina, corrispondenti a regioni specifiche dei trascritti da esaminare.
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/12 → …

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