Identificazione di proteine con attività di legame al DNA di Nonomuraea sp. ATCC 39727

Nonomuraea sp. ATCC39727 è un attinomicete produttore dell'antibiotico A40926, precursore della dalbavancina, attualmente in fase tre di sperimentazione clinica nel trattamento di infezioni causate da batteri gram-positivi patogeni resistenti ad un ampio spettro di antibiotici. L’A40926 è un lipoglicopeptide sintetizzato da un enzima multimodulare per via non ribosomale attraverso un complesso pathway biosintetico. I geni codificanti gli enzimi responsabili della biosintesi, regolazione, resistenza e trasporto dell'antibiotico sono 37 e sono organizzati in un cluster di 70 kb, chiamato cluster dbv. La produzione di A40926 è regolata negativamente dal fosfato. In condizioni limitanti di fosfato, infatti aumenta l’espressione del regolatore pathway-specifico Dbv4, che attiva la trascrizione di geni biosintetici chiave. Lo scopo del progetto è quello di identificare le proteine di regolazione, che risentono della concentrazione di fosfato e attivano la trascrizione di dbv4 attraverso la ricerca di proteine che legano il DNA mediante saggi di mobilità elettroforetica di frammenti di DNA a monte del gene regolatore pathway- specifico dbv4 in presenza delle proteine totali di Nonomuraea. I risultati ottenuti chiariranno i meccanismi di regolazione della produzione degli antibiotici glicopeptidici e potrebbero essere utilizzati per migliorarne la produttività.

Dbv4 è il regolatore pathway specifico del cluster dbv di Nonomuraea; infatti, regola positivamente la trascrizione degli operoni dbv14-dbv8 e dbv30-dbv35 che codificano per enzimi chiave della biosintesi dell'antibiotico A40926 in condizioni limitanti di fosfato (Alduina et al., 2007). In particolare, i geni dbv30-35 codificano per gli enzimi che sintetizzano uno dei due aminoacidi non proteinogenici incorporati nello scheletro eptapeptidico dell'antibiotico, mentre i geni dbv14-dbv8 codificano per gli enzimi del tailoring che modificano il peptide rendendolo attivo. Ad oggi non si conoscono le proteine che regolano la trascrizione di questo gene. Lo scopo di questa ricerca è quello di identificare il/i fattore/i proteico/i in grado di attivare la trascrizione del gene dbv4. L’identificazione del/i regolatore/i del cluster dbv consentirà un miglioramento della produzione e una riduzione dei costi di un nuovo e rivoluzionario antibiotico glicopeptidico: la dalbavancina. Per identificare il gene (o i geni) regolatore (i) dell'espressione di dbv4 in condizioni limitanti di fosfato, saranno effettuati saggi di mobilità elettroforetica di un frammento di DNA localizzato a monte del gene dbv4, chiamato P4, e differenti frazioni proteiche. Le proteine totali saranno estratte da Nonomuraea, incubata in terreno di produzione, dopo 18 e 42h di crescita mediante sonicazione in un tampone non denaturante. Le proteine totali saranno frazionate in base al differente peso molecolare, solubilità in concentrazioni crescenti di ammonio solfato e capacità di legare resine cromatografiche. Dopo ogni frazionamento, la presenza della proteina legante P4 nelle differenti frazioni proteiche sarà monitorata mediante saggi di mobilità elettroforetica di P4. Infine, la frazione proteica arricchita della proteina con attività di legame a P4 sarà recuperata mediante pull down: saranno usate sferette magnetiche rivestite di streptavidina per legare P4 biotinilato e questa miscela sarà incubata in presenza della frazione proteica legante P4. Le proteine leganti P4 saranno identificate mediante analisi SDS-PAGE e 2D-PAGE e caratterizzate mediante spettrometria di massa secondo la procedura descritta in Uguru et al.,2005 e Fujii et al., 2005. I geni codificanti per proteine che legano il promotore di dbv4 saranno identificati e isolati da una libreria genomica di Nonomuraea (Alduina et al., 2005) mediante colony hybridisation. Le sonde saranno preparate mediante PCR usando primer disegnati in base alla sequenza aminoacidica e il codon usage degli attinomiceti.