Identificazione dei meccanismi di instabilità cromosomica in cellule umane in coltura

Progetto: Research project

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La maggior parte dei tumori umani è caratterizzata sia da instabilità cromosomica (CIN) che da amplificazione dei centrosomi. Quest'ultima è stata correlata con l’instabilità cromosomica osservata sia in tumori aggressivi che in lesioni pre-neoplastiche. Risultati da noi ottenuti in fibroblasti umani in coltura suggeriscono che la mancanza del gene oncosoppressore Rb possa indurre la generazione di centrosomi multipli e aneuploidia alterando rispettivamente l’espressione di geni coinvolti nell'omeostasi dei centrosomi e inducendo difetti in componenti del checkpoint mitotico.Come sistema modello saranno usate cellule HCT116 derivate da colon carcinoma e che non mostrano il fenotipo CIN. In queste cellule mediante RNA interference saranno silenziati il gene codificante la chinasi Aurora-A coinvolta nel pathway di duplicazione dei centrosomi, il gene Polo Like Kinase 1 (PLK1) un’importante chinasi mitotica la cui alterata funzionalià nell’omeostasi dei centrosomi non è completamete chiarita e il gene BRCA1, spesso associato con instabilità genetica, il cui prodotto è stato localizzato al centrosoma durante la mitosi. Il silenziamento trascrizionale di questi geni sarà associato a quello di Rb. Sarà anche valutata la correlazione tra l'espressione di BRCA1 e MAD2 componente cruciale del checkpoint mitotico. La strategia di RNA interference sarà applicata anche a cellule umane primarie per convalidare l’ipotesi che alterazioni nell’espressione di alcuni di questi geni possa esere coinvolta nella generazione di aneuploidia in assenza di ulteriori mutazioni. L' obiettivo generale del progetto è quello di individuare un possibile pathway la cui alterazione generi l'aneuploidia e incui possono essere coinvolti geni associati con l'omeostasi dei centrosomi e/o geni coinvolti incheckpoints funzionanti in mitosi.

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2.1 Obiettivi L'obiettivo generale del progetto è quello di comprendere il/i meccanismo/i alla base dell'instabilità cromosomica in cellule umane analizzando la correlazione tra fenotipo CIN e alterazione dell'espressione di geni oncosoppressori e di geni coinvolti nel checkpoint mitotico e nell'omeostasi dei centrosomi. L'instabilità cromosomica (aneuploidia) è ritenuta essenziale per l'inizio e la progressione tumorale ma potrebbe rappresentare un punto debole della tumorigenesi quando nelle cellule tumorali venga ripristinata la funzionalità di un checkpoint che controlla la corretta ploidia. La comprensione delle basi molecolari della generazione di instabilità cromosomica potrebbe dunque generare nuovi approcci terapeutici per la cura e il trattamento dei tumori umani. 2.2 Metodologie L'RNA interference consiste nel silenziamento post-trascrizionale di RNA messageri omologhi in sequenza a RNA a doppio filamento di lunghezza pari a 21-23 nt. Questi RNA a doppio filamento sintetizzati in vitro sono ritenuti potenti reagenti per mediare il silenziamento genico, e sono efficaci a concentrazioni molto più basse di quelle usate nelle strategie antisenso convenzionali.L'introduzione diretta dei dsRNA sarà effettuata mediante trasfezione per mezzo di un carrier lipidico (Lipofectamine 2000, Invitrogen). Come controllo negativo sarà utilizzato un siRNA diretto contro il gene della luciferasi. Dopo la trasfezione degli siRNA i lisati cellulari saranno sottoposti ad analisi western blot per valutare la riduzione di espressione della proteina corrispondente, mediante Real time RT-PCR sarà valuatata la riduzione del livello di mRNA corrispondente ai geni silenziati. Valutazione della distribuzione nel ciclo cellulare, re-replicazione del DNA e apoptosi mediante analisi citofluorimetrica dopo la trasfezione con gli siRNA per BRCA1, PLK1 e Aurora-A. Valutazione degli effetti degli siRNA sulla ploidia e sul numero dei centrosomi in cellule tumorali HCT116 coltivate in vitro mediante analisi citogenetica e immunocitochimica.
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/07 → …

Fingerprint

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