Identificazione dei meccanismi di instabilità cromosomica in cellule umane in coltura

Progetto: Research project

Dettagli progetto

Description

La maggior parte dei tumori umani è caratterizzata sia da instabilità cromosomica (CIN) sia da amplificazione dei centrosomi. Quest'ultima è stata correlata con l’instabilità cromosomica osservata sia in tumori aggressivi che in lesioni pre-neoplastiche. Da risultati da noi ottenuti in precedenza ipotizziamo che la mancanza del gene oncosoppressore Rb induce amplificazione dei centrosomi e aneuploidia alterando rispettivamente l’espressione dei geni: cyclin E, Aurora-A, PLK1, BRCA1, NPM, Nek2 e inducendo difetti in componenti del checkpoint mitotico come MAD2. Come sistema modello saranno usate cellule HCT116 che non mostrano CIN. In queste cellule mediante RNA interference sarà abolita la funzione di geni coinvolti nel controllo della duplicazione dei centrosomi o dell’instabilità genetica. In particolare saranno silenziati, per mezzo di siRNA specifici, il gene Nucleophosmin/B23 (NPM), associato con centrosomi non duplicati, e la chinasi Aurora A coinvolta nel pathway di maturazione dei centrosomi. Altri bersagli per gli esperimenti di RNA interference saranno il gene BRCA1, spesso associato con instabilità genetica e il cui prodotto è stato localizzato al centrosoma durante la mitosi, e il gene Polo Like Kinase 1 (PLK1) che è un’importante chinasi mitotica la cui alterata funzionalià nell’omeostasi dei centrosomi non è completamete chiarita. La strategia di RNA interference sarà applicata anche a cellule primarie per convalidare l’ipotesi che alterazioni nell’espressione di alcuni di questi geni possa esere coinvolta nella generazione di aneuploidia. L'obiettivo generale del progetto è quello di comprendere il/i meccanismo/i alla base dell 'instabilità cromosomica in cellule umane analizzando la possibile correlazione tra fenotipo CIN e alterazioni in geni oncosoppressori e in geni coinvolti nell'omeostasi dei centrosomi.

Layman's description

L' obiettivo del progetto è quello di comprendere più in dettaglio, un possibile pathway che media l'aneuploidia e in cui possono essere coinvolti geni associati con l'omeostasi dei centrosomi e/o l'instabilità genetica. Sebbene l'instabilità cromosomica è ritenuta essenziale per l'inizio e la progressione tumorale potrebbe rappresentare un punto debole quando nel tumore si ripristina la funzionalità di un possibile checkpoint che controlla la ploidia. La comprensione delle basi molecolari della generazione di instabilità cromosomica potrebbe generare nuovi approcci terapeutici per la cura e il trattamento dei tumori. - Metodologie L'RNA interference consiste nel silenziamento post-trascrizionale di RNA messageri omologhi in sequenza a RNA a doppio filamento di lunghezza pari a 21-23 nt. Questi RNA a doppio filamento sintetizzati in vitro sono ritenuti potenti reagenti per mediare il silenziamento genico, e sono efficaci a concentrazioni molto più basse di quelle usate nelle strategie antisenso convenzionali.L'introduzione diretta dei dsRNA sarà effettuata mediante trasfezione per mezzo di un carrier lipidico (Lipofectamine 2000, Invitrogen). Come controllo negativo sarà utilizzato un siRNA nonspecifico diretto contro il gene della luciferasi. Dopo la trasfezione degli siRNA i lisati cellulari saranno sottoposti ad analisi western blot per valutare la riduzione di espressione della proteina corrispondente, mediante RT-PCR sarà valuatata la riduzione del livello di mRNA corrispondente. Valutazione della distribuzione nel ciclo cellulare, re-replicazione del DNA e apoptosi mediante analisi citofluorimetrica dopo la trasfezione con gli siRNA per BRCA1, PLK1 e Aurora A. Valutazione degli effetti degli siRNA sulla ploidia in cellule tumorali HCT116 mediante analisi citogenetica e immunocitochimica.
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/05 → …

Fingerprint

Esplora i temi di ricerca toccati da questo progetto. Queste etichette sono generate sulla base dei riconoscimenti/sovvenzioni sottostanti. Insieme formano una fingerprint unica.