I fattori di sopravvivenza nelle cellule di epatoblastoma umano in coltura. Ruolo di Akt.

Progetto: Research project

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Per la realizzazione di questo progetto verranno impiegate alcune linee cellulari di epatoma umano (HepG2, HuH-6, SK-Hep1) in coltura che saranno trattate con vari induttori di morte quali inibitori del proteasoma, inibitori delle deacetilasi istoniche, caliculina, desipramina, endocannabinoidi, statine. Ci proponiamo di: 1. Approfondire, tramite esperimenti di immunoprecipitazione, gli studi sull’interazione di HSP70 con fattori apoptotici. Particolare attenzione verrà dedicata all’interazione con AIF. E’ noto che questo fattore trasloca dal mitocondrio nel nucleo dove è implicato nella condensazione della cromatina. Intendiamo valutare l’interazione di HSP70 con AIF nelle diverse frazioni subcellulari (citosol, mitocondrio e nucleo). 2. Utilizzare la quercetina per inibire la sintesi di HSP70. Valutare gli effetti della quercetina sul sequestramento dei fattori proapoptotici. Valutare se il composto è in grado di potenziare gli effetti di morte indotti dalle droghe apoptotiche. 3. Studiare gli effetti delle droghe apoptotiche sull’espressione di Akt e sullo stato di fosforilazione della molecola. 4. Valutare se le diverse droghe apoptotiche impiegate sono in grado di attivare fosfatasi responsabili della defosforilazione di fosfo-Akt, inibendo in tal modo l’azione anti-apoptotica e protettiva della stessa Akt. 5. Studiare gli effetti delle droghe apoptotiche sull’espressione, sullo stato di fosforilazione e sulla localizzazione subcellulare del fattore proapototico BAD. In particolare vogliamo valutare se il trattamento determina il prevalere della forma defosforilata di BAD con conseguente distacco di tale fattore dalla proteina 14-3-3 e sua conseguente traslocazione dal citosol al mitocondrio.

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2.1 Obiettivi Nell’ambito di un vasto studio sui sistemi di difesa che le cellule predispongono contro l’apoptosi intendiamo studiare in numerose cellule tumorali, trattate con induttori di apoptosi: - il ruolo esercitato da HSP70 nel contrastare eventi apoptotici e in particolare l’attività di AIF; - il ruolo di Akt nel proteggere le cellule dall’induzione dell’apoptosi, regolando lo stato di fosforilazione e l’attività del fattore proapoptotico BAD. Metodologie Il progetto si propone di impiegare le seguenti linee cellulari umane: Chang liver (cellule epatiche immortalizzate non tumorali), HepG2 (cellule di epatoblastoma), HuH-6 ed SK-Hep1 (cellule di epatocarcinoma). Le cellule saranno trattate per tempi variabili con varie droghe apoptotiche. Gli effetti citotossici indotti saranno studiati sia attraverso la colorazione delle cellule con trypan blue che mediante il test dello MTT. Verranno eseguiti anche saggi citofluorimetrici per discriminare quantitativamente la frazione di cellule vive da quelle con DNA frammentato. Lo studio dell’apoptosi verrà effettuato con l’impiego dell’Annexina V, una proteina che lega la fosfatidilserina, un fosfolipide che trasloca dalla parte interna della membrana a quella esterna nelle fasi iniziali dell’evento apoptotico. In particolare l’impiego di Annexina V-FITC permetterà di evidenziare le cellule in apoptosi precoce e distinguerle da quelle già in tarda apoptosi o in necrosi. Saggi colorimetrici che utilizzano specifici substrati coniugati con paranitroanilina (DEVD-pNA,YVAD-pNA, ecc.) saranno impiegati per accertare la capacità degli induttori di morte nel promuovere l’attività delle caspasi. Per chiarire il ruolo protettivo esplicato da HSP70 nella risposta all'induzione di morte, l’espressione di questo fattore verrà ridotta utilizzando la quercetina, composto in grado di inibirne la sintesi e la traslocazione nucleare. La presenza di complessi tra HSP70 e altri fattori coinvolti nell’apoptosi sarà valutata mediante studi di immunoprecipitazione. In particolare, estratti proteici, preparati da cellule trattate e non, saranno incubati con un anticorpo anti-HSP70 e i complessi precipitati tramite beads di sepharose coniugate con proteina A. Le molecole complessate con HSP70 verranno successivamente evidenziate mediante analisi di western blotting. Sempre mediante esperimenti di western blotting desideriamo accertare se l’esposizione alle droghe è in grado di modificare il livello di proteine con attività pro o antiapoptotica. Riteniamo particolarmente interessante valutare l'interazione di HSP70 con il fattore AIF nei vari distretti subcellulari. Eventuali variazioni della espressione genica delle proteine coinvolte negli eventi apoptotici verranno valutate mediante RT-PCR semiquantitativa. La capacità di binding al DNA di HSF1 sarà studiata mediante esperimenti di gel shift. A tal proposito gli estratti nucleari di cellule esposte a condizioni di stress saranno incubati in presenza di oligonucleotidi marcati con 32P contenenti la sequenza consensus del fattore in oggetto. I complessi DNA-proteine saranno sottoposti ad elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti e visualizzati per autoradiografia. Le proteine Akt, p-Akt, BAD, p-BAD, e 14-3-3 verranno studiate sempre per W/B. Dosaggi ELISA permetteranno di studiare l'attività di fosfatasi in grado di inattivare Akt.
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/05 → …

Fingerprint

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