Espressione genica nel riccio di mare: i geni neurali di tubulina, la p38 nello stress e nella morfogenesi

Progetto: Research project

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La ricerca proposta essenzialmente si occupa di delucidare alcuni meccanismi di regolazione dell’espressione genica nel modello sperimentale P. lividus. Il riccio di mare è uno tra i modelli embrionali più usati per lo studio dell’espressione genica. E’ noto che quando l’embrione giunge allo stadio di 64 blastomeri si iniziano a differenziare 5 territori presuntivi, in ciascuno dei quali si può identificare un “set” specifico di cellule fondatrici da cui derivano cloni cellulari che vanno incontro ad un destino predeterminato. Negli stadi embrionali tardivi, le cellule policlonali esprimono specifici geni che portano al differenziamento dei tessuti e tali geni vengono definiti “marker molecolari” di questi territori. Nel nostro laboratorio da anni si studia la regolazione dell’espressione genica riguardante le due famiglie multigeniche di alfa e beta tubulina in Paracentrotus lividus ed in particolare l’espressione di due specifici geni marcatori molecolari del tessuto neurale di riccio: PlTalfa2 e PlTbeta3. Questo studio è incentrato sull’identificazione delle sequenze regolatrici dei due differenti geni che determinano la specifica espressione spazio temporale dei trascritti e degli isotipi proteici (screening di librerie genomiche, sequenziamento, analisi EMSA e Footprinting) e sullo studio funzionale di queste sequenze regolatrici ( costruzioni di specifici plasmidi chimerici contenenti geni reporter, microiniezioni in uova di riccio di mare, esperimenti di delezione effettuati sulle sequenze regolatrici per identificare le sequenze minime con ruoli regolativi). Un altro aspetto dello studio riguarda l’espressione genica durante lo sviluppo embrionale del riccio di mare e questo aspetto è correlato con l’acclarata induzione di eventi morfogenetici , nei metazoi, da parte di specifici patways di segnalamento. Poiché abbiamo in precedenza dimostrato che nel P. lividus un particolare stress osmotico induce nella larva natante la deciliazione, una risposta da stress e l’acquisizione di termotolleranza mediante l’attivazione di un patway di trasduzione innescato dalla p38MAPK, ed abbiamo anche recentemente dimostrato che l’attivazione della p38MAPK è correlata con la scheletogenesi della larva, intendiamo analizzare la presenza di eventuali isoforme proteiche della p38MAPK nel riccio di mare (l’esistenza di isoforme della p38 è stata dimostrata in altri organismi ma non nel riccio di mare) e correlare in maniera specifica le diverse isoforme con eventi da stress come lo shock termico, la deciliazione, lo shock da metalli pesanti, e con eventi morfogenetici come la gastrulazione e la scheletogenesi.

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Obiettivi Gli obiettivi di questo progetto di ricerca sono: 1) identificare la regione minima del promotore del gene Talfa2 in grado di dirigere la corretta espressione temporale del gene effettuando microiniezioni in uova di Paracentrotus lividus di costruzioni sequenzialmente delete del promotore. 2) Isolare un clone genomico, mediante la tecnica del Chromosome Walking, contenente una regione più estesa del promotore del gene Talfa2. Infatti le sequenze del promotore da noi in precedenza isolate non sembrano contenere gli elementi regolativi capaci di dirigere la corretta espressione spaziale del gene. Abbiamo già analizzato una libreria genomica appositamente costruita e stiamo analizzando dei “cloni candidati” 3) Una volta isolato il/i corretto/i clone/i procederemo all’analisi funzionale di questa regione aggiuntiva del promotore Talfa2, effettuando saggi di microiniezione per stabilire la presenza o meno in queste sequenze di elementi regolativi responsabili della corretta espressione spaziale del gene. Se questo approccio sperimentale dovesse dare risultati confortanti, procederemo con l’analisi biochimica di tali sequenze (saggi EMSA e di DNAse-Footprinting) per identificare le specifiche sequenze regolative 4) Per quanto riguarda il presunto promotore di Tbeta3, dobbiamo innanzi tutto verificare se i mancati risultati funzionali derivano specificamente dal clone da noi costruito. Per verificare se tale clone comprende sequenze “velenose” intendiamo mettere a punto un sistema di microiniezione di amplificati parziali del clone ricombinante (contenenti soltanto le sequenze del presunto promotore e le sequenze codificanti per il reporter pGreen). A seconda dei risultati ottenuti procederemo portando avanti l’analisi funzionale/biochimica delle sequenze da noi già isolate, oppure procederemo all’analisi di una libreria genomica per isolare un nuovo clone genomico codificante per l’isotipo beta3. 5) Per quanto riguarda lo studio della p38MAPK intendiamo studiare il coinvolgimento dell’attivazione della p38 negli eventi morfogenetici del riccio di mare correlati alla gastrulazione. Infatti i risultati ottenuti in precedenza riguardanti la scheletogenesi suggeriscono che la regolazione dell’attività chinasica della p38 (fosforilazione/defosforilazione) possa anche essere implicata nella determinazione del “blastoporo”. Infine intendiamo studiare ,con l’uso di specifici inibitori, il coinvolgimento di specifiche isoforme della p38 in diversi eventi di stress (deciliazione, heat shock, metalli pesanti) e nei diversi eventi morfogenetici che avvengono durante lo sviluppo embrionale del riccio di mare. Metodi Microiniezioni in uova di riccio di mare Le uova di un singolo individuo verranno separate dalle gonadi per filtrazione, lavate in MFSW (acqua di mare filtrata e tamponata) e degelificate. Le uova verranno quindi depositate sulla faccia interna di un coperchio di una capsula petri da 60 mm di diametro, trattata preventivamente con protammin-solfato 0.25%. Vengono quindi microiniettati 2 picolitri di una soluzione contenente 50 ng/?l della specifica costruzione chimerica da saggiare, (un clone ricombinante preventivamente linearizzato mediante restrizione con l’opportuno enzima, o un prodotto di amplificazione) in 25% glicerolo. Dopo la fecondazione le uova verranno poste a 18°C, lasciate sviluppare e osservate al microscopio a fluorescenza durante lo sviluppo. PCR dei frammenti contenenti il gene reporter GFP da microiniettare I frammenti di DNA da microiniettare saranno amplificati, vista la loro lunghezza, utilizzando l’enzima Pfx Platinum polimerasi in presenza dell’appropriato buffer di reazione. Come DNA stampo saranno utilizzati 10 ng/reazione dei cloni contenenti o il promotore di Talfa2 o il promotore di Tbeta3 a monte del gene reporter pGreen lantern1 Marcatura delle sonde molecolari, il subclonaggio e la trasformazione saranno effettuati rispettivamen
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/05 → …

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