Espressione genica nel riccio di mare: i geni neurali di tubulina, la p38 nello stress e nella morfogenesi

Progetto: Research project

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La ricerca si propone di delucidare i meccanismi che presiedono alla regolazione dell’espressione genica nel P. lividus. Il riccio di mare è un ottimo modello per lo studio dell’espressione genica correlata con il differenziamento e l'embriogenesi/morfogenesi. E’ noto infatti che quando l’embrione giunge allo stadio di 64 blastomeri si differenziano 5 territori presuntivi, ciascuno dei quali è formato da cellule fondatrici da cui derivano i cloni cellulari che andranno incontro ad un destino predeterminato. Negli stadi embrionali tardivi, i vari territori esprimono specifici geni (marcatori molecolari) che portano al differenziamento dei diversi tessuti. Nel nostro laboratorio da anni si studiano i meccanismi di regolazione che presiedono l’espressione di due specifici geni di tubulina, marcatori molecolari del tessuto neurale di riccio: PlTalfa2 e PlTbeta3, entrambi i geni codificano infatti per tubuline assonali che a partire dallo stadio di blastula vengono espresse coordinatamente in tutte le strutture neurali dell’embrione (nel dominio apicale, nella banda ciliata, nei gangli). Allo scopo di identificare le sequenze regolatrici dei due differenti geni, sono stati condotti - e vengono attualmente condotti- analisi di librerie genomiche per l'identificazione e l’isolamento di specifiche sequenze, il sequenziamento dei cloni isolati, analisi EMSA, Footprinting e studi funzionali (microiniezioni in uova di riccio di mare di costrutti chimerici contenenti geni reporter, come GFP, posti sotto il controllo delle presunte sequenze regolatrici per dimostrarne il reale ruolo funzionale; esperimenti di delezione effettuati sulle sequenze regolatrici per identificare le sequenze minime con ruoli regolativi). Un altro aspetto dello studio riguarda l’espressione genica durante lo sviluppo embrionale del riccio di mare e questo aspetto è correlato con l’acclarata induzione di eventi morfogenetici, nei metazoi, da parte di specifici patways di segnalamento. Abbiamo in precedenza dimostrato che nel P. lividus un particolare stress osmotico induce nella larva natante la perdita delle cilia (che, terminato lo stress osmotico, ricresceranno) e di conseguenza una risposta da stress e l’acquisizione di termotolleranza mediante l’attivazione di un patway di trasduzione innescato dalla p38MAPK, e, recentemente, abbiamo anche verificato che durante lo sviluppo embrionale di P. lividus esistono picchi di attivazione della p38MAPK in concomitanza con i principali eventi morfogenetici dell’embrione, intendiamo pertanto analizzare i) la presenza di eventuali isoforme proteiche della p38MAPK nel riccio di mare (l’esistenza di isoforme della p38 è stata dimostrata in altri organismi ma non nel riccio di mare) e ii) correlare in maniera specifica le diverse isoforme con eventi da stress come lo shock termico, la deciliazione, lo shock da metalli pesanti, e con eventi morfogenetici come la gastrulazione e la scheletogenesi.

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Obiettivi Gli obiettivi di questo progetto di ricerca sono essenzialmente: 1) Analizzare le sequenze del promotore completo del gene Talfa2 isolate, utilizzando la tecnica del “chromosome walking”, mediante screening di una libreria genomica di P.lividus. Abbiamo infatti isolato e sequenziato circa 3,5 Kb aggiuntive rispetto al promotore minimo in precedenza caratterizzato, che -analisi preliminari- indicano contenere gli elementi in cis responsabili della corretta espressione spaziale del gene Talfa2. Analisi funzionali, mediante microiniezione in “embrioni” di P.lividus, di costrutti del promotore sequenzialmente deleti ci consentiranno di identificare la regione minima contenente le sequenze responsabili della corretta espressione spaziale; saggi di Footprinting ci consentiranno l’identificazione delle specifiche sequenze; ed infine saggi funzionali di competizione (con multimeri delle sequenze identificate) dimostreranno il reale ruolo funzionale di tali sequenze. 2) Per quanto riguarda l’espressione del gene neurale Tbeta3, abbiamo già isolato un nuovo clone genomico (il clone da noi in precedenza isolato ed analizzato era probabilmente uno pseudogene) che contiene sia le sequenze genomiche codificanti per l’isotipo Beta2 che per l’isotipo Beta3 stiamo analizzando l’organizzazione molecolare di entrambi i geni all'interno del clone isolato. Analisi di restrizione preliminari indicherebbero la presenza di circa 2,5/3 Kb di sequenze a monte della regione codificante, suggerendo la presenza in questo clone di possibili sequenze regolatrici che studieremo con le tecniche già utilizzate per lo studio del gene Talfa2. 3) Per quanto riguarda lo studio della p38MAPK intendiamo studiare il ruolo della p38 negli eventi morfogenetici del riccio di mare correlati con la scheletogenesi, ed il coinvolgimento di ognuna delle specifiche isoforme della p38 presenti in P.lividus nei diversi eventi di stress (deciliazione, heat shock, metalli pesanti). Metodi Microiniezioni in uova di riccio di mare: Le uova di un singolo individuo verranno separate dalle gonadi per filtrazione, lavate in MFSW (acqua di mare filtrata e tamponata) e degelificate. Le uova verranno quindi depositate sulla faccia interna di un coperchio di una capsula petri da 60 mm di diametro, trattata preventivamente con protammin-solfato 0.25%. Vengono quindi microiniettati 2 picolitri di una soluzione contenente 50 ng/microL della specifica costruzione chimerica da saggiare, (un amplificato mutimerico contenente le presunte sequenze regolatrici, o delezioni di esse, poste a monte delle sequenze codificanti per la proteina fluorescente GFP) in 25% glicerolo. Dopo la fecondazione le uova verranno poste a 18°C, lasciate sviluppare e osservate al microscopio a fluorescenza durante il loro sviluppo. I frammenti di DNA da microiniettare saranno amplificati con opportuni oligonucleotidi innesco e, vista la loro lunghezza, utilizzando l’enzima Pfx Platinum polimerasi in presenza dell’appropriato buffer di reazione. Come DNA stampo saranno utilizzati 10 ng/reazione dei cloni contenenti o il promotore di Talfa2 o il promotore di Tbeta3 a monte del gene reporter pGreen lantern1 La marcatura delle diverse sonde molecolari, il subclonaggio e le trasformazioni saranno effettuati rispettivamente con il metodo "random primed" (boheringher), e con le procedure standard descritte nel manuale Sambrook et al. Culture di embrioni di P.lividus: Embrioni di P. lividus verranno coltivati nelle normali condizioni di cultura , ed in presenza di agenti che interferiscono con la normale morfogenesi (ad es. il NiCl2), di agenti/o condizioni di sviluppo in grado di indurre stress, e/o di inibitori specifici dell'attività della p38MAPK. Western-blot: SDS-PAGE e Western blot (mono e bidimensionali) saranno eseguiti secondo le tecniche messe a punto nel nostro laboratorio. Saranno utilizzati anticorpi monoclonali anti-nonactivated p38 MAPK e
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/06 → …

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