Espressione ed attivazione di p38 MAPK in embrioni di Paracentrotus lividus durante lo sviluppo ed in seguito a stress

Il programma di ricerca prevede lo studio dell’espressione del gene dell’isotipo alfa della p38 MAPK sia durante lo sviluppo dell’embrone di riccio di mare P. lividus che in seguito a stimoli capaci di indurre stress di natura diversa. Altro obiettivo del progetto è quello di verificare la presenza di isotipi proteici diversi di p38 e di analizzarne l'eventuale diversa attivazione durante i vari stadi di sviluppo ed in seguito a stress. Per individuare il numero dei geni codificanti perl’isotipo alfa della p38MAPK saranno condotti esperimenti di Southern blot. DNA genomico estratto da singoli individui adulti verrà digerito con enzimi di restrizione, sottoposto ad elettroforesi su gel di agarosio e trasferito su membrana di nylon. L’ibridazione verrà eseguita utilizzando come sonda il frammento di 340 bp corrispondente alla sequenza di p38 MAPK (ottenuto per RT-PCR), marcato con digossigenina. Allo scopo di misurare i livelli del trascritto nei diversi stadi di sviluppo verranno estratti gli RNA totali da embrioni allo stadio di 2 blastomeri, morula, gastrula iniziale e avanzata. Verrà utilizzata una variante della tecnica di RT-PCR, chiamata RT-PCR semiquantitativa “multiplex” (Spencer & Christensen 1999. Biotechniques 27: 1044, modificata da Luparello et al. 2003 J Cell Sci 116:.2421) che permette di stimare differenze di abbondanza di specifici RNA senza utilizzare radioisotopi. L’RNA di interesse viene co-amplificato con l’RNA ribosomale 28S, la cui quantità è costante nei vari campioni, in un range di cicli nei quali entrambe le reazioni di amplificazione seguono un andamento esponenziale. I risultati verranno verificati tramite RT-PCR quantitativa. Le medesime tecniche verranno applicate per quantificare i livelli di trascritto di p38 alfa in seguito a stress di natura diversa analizzando RNA estratti da embrioni sottoposti a 4 differenti tipi di stress: da calore, da deciliazione, da zinco e da cadmio. La scelta di questi trattamenti è motivata dal fatto che essi attivano la sintesi differenziale di diverse proteine da stress (Roccheri et al. 1993 J Submicrosc Cytol Pathol 25:173; Casano et al 1998 Biochem Biophys Res Commun 248: 628). Infatti, in seguito al trattamento con calore viene attivata la sintesi di 16 hsps; lo stress da deciliazione provoca l'incremento della velocità di sintesi di due sole proteine; il trattamento con ZnSO4 incrementa la sintesi di 7 hsps. Per quanto riguarda il cadmio, esso attiva la sintesi di un numero variabile di hsps (da 2 a 6) a seconda del periodo di esposizione (Roccheri et al. 2004 Biochem Biophys Res Commun 321:80). Verrà scelto il trattamento di 18 ore che provoca l’attivazione di 6 hsps. Per verificare la presenza di isotipi diversi di p38 e l’eventuale modulazione della loro attività saranno condotte delle elettroforesi bidimensionali, seguite da western blot condotti utilizzando anticorpi eterologhi monoclonali, altamente specifici per la forma attiva (bi-fosforilata) o inattiva (non fosforilata o monofosforilata). Immunolocalizzazioni su embrione intero e su sezioni ci permetteranno di localizzare la forma attiva e inattiva della p38 sia a livello dei diversi territori degli embrioni sottoposti ai vari stress, sia nei compartimenti sub-cellulari in embrioni a stadi di sviluppo precoce (fino a 4-8 blastomeri).

I primi dati riguardanti la p38 in P. lividus risalgono al 2003 (Casano et al. 2003. Cell Stress & Chaperones 8: 708) e correlano l’attivazione di questa kinasi all’acquisizione della termotolleranza. La termotolleranza indotta dalla deciliazione è dovuta infatti all'attivazione di una cascata di fosforilazioni il cui effettore è la p38 MAPK. Più recentemente, in Lytechinus variegatus, è stato dimostrato che l’attivazione di p38 è essenziale per la specificazione dell’asse oro-aborale attraverso la promozione dell’espressione di Nodal nel territorio orale (Bradham & McClay 2006. Development 133: 216). La p38 MAPK riveste quindi un ruolo centrale sia nello sviluppo che nella risposta da stress nel riccio di mare. I meccanismi di controllo di questo enzima sono certamente vari e a più livelli. Essendo una MAPK, la p38 viene preferenzialmente regolata attraverso la fosforilazione dipendente da specifiche MKK. Altro punto di controllo, intimamente legato al precedente è quello delle fosfatasi che sembrano essere direttamente coinvolte nello spegnere l’attività delle MAPK (e quindi anche della p38) o anche nel farne variare la stabilità o la localizzazione. Un controllo aggiuntivo potrebbe essere quello della regolazione dell’espressione genica che potrebbe variare oltre che in funzione dello stadio di sviluppo, anche in risposta a stimoli diversi. Conducendo un’analisi comparativa tra la sequenza di p38 di Lytechinus variegatus (Bradham & McClay 2006) e le sequenze EST di P. lividus abbiamo identificato un clone (PK0AAA40YF22RM1.SCF) che presenta un’alta omologia con la sequenza dell’RNA messaggero di p38 MAPK di L. variegatus. Questa sequenza ci ha permesso di disegnare due primers che sono stati utilizzati per esperimenti di RT-PCR. Il sequenziamento del frammento da 340 bp ottenuto da questa RT-PCR ha mostrato una completa omologia con la sequenza EST di P. lividus. L’analisi della sequenza ha permesso inoltre di attribuire questo trascritto all’isoforma alfa di p38. Questa regione presenta infatti il sito di legame per SB203580, un inibitore di p38 specifico per l’isoforma alfa. Lo scopo di questo progetto è quello di stabilire: 1) quanti sono i geni codificanti l’isotipo alfa della p38MAPK 2) se l’espressione di questo gene è modulata durante lo sviluppo 3) se stress di natura diversa modulano differentemente l’espressione di p38 4) se anche nel riccio di mare esistono isotipi diversi di p38 e se la loro attivazione è modulata durante lo sviluppo ed in seguito a stress 5) se la localizzazione della forma attiva e inattiva varia in seguito ai diversi trattamenti Questi dati, insieme a future indagini sul coinvolgimento delle fosfatasi delle MAPK, permetteranno di avere un quadro più preciso dei meccanismi di regolazione di kinasi che sono coinvolte in processi così fondamentali per l’organismo e di fare interessanti paralleli con i meccanismi di regolazione in altre specie, fra le quali l’uomo.