Effetto di componenti del microambiente sull'espressione genica di cellule di epitelio mammario umano tumorale ed immortalizzato

Il presente progetto di ricerca rappresenta una continuazione di quello condotto negli anni precedenti, ed è focalizzato sullo studio del ruolo di alcune componenti del microambiente colturale, collagene tipo V, cadmio e "parathyroid hormone-related protein" (PTHrP) sull'espressione genica di cellule di carcinoma mammario umano in coltura e di epitelio mammario non tumorale ma "immortalizzate". In particolare lo studio sarà focalizzato sull'individuazione di geni differenzialmente espressi in risposta alla somministrazione dei diversi fattori nel microambiente, tramite esperimenti di "differential display"- e "semi-quantitative multiplex" PCR.

Lo scopo del presente progetto è di ottenere informazioni più dettagliate sull'effetto del collagene tipo V, del PTHrP [38-94] e del cloruro di cadmio sulla biologia delle cellule di epitelio mammario tumorale e/o immortalizzato. In particolare, sarà esaminato l'effetto esercitato da tali fattori del microambiente colturale sulla modulazione dell'espressione genica, sia in maniera mirata, cioè indagando su prodotti genici che siano espressione del fenotipo differenziato di tali citotipi, che ricercando geni differenzialmente espressi tramite la tecnica del "differential display"-PCR. RNA totale e/o messaggero sarà estratto da cellule controllo e trattate con PTHrP [38-94], cloruro di cadmio, o coltivate su substrati di collagene tipo V, e verrà sottoposto a retro-trascrizione. Le preparazioni di cDNA ottenute saranno sottoposte ad analisi tramite PCR convenzionale per evidenziare la presenza di bande indicative dell’espressione dei geni ricercati, e tramite PCR multiplex semiquantitativa per esaminare le possibili differenze nei livelli di espressione dei geni. In parallelo, si eseguiranno esperimenti di “differential display-PCR” tramite i quali i cDNA di geni differenzialmente espressi vengono identificati a seguito di analisi di sequenze interne usando esameri “random” per la retro-trascrizione degli RNA e “primers” arbitrari per l’amplificazione. I prodotti di amplificazione saranno analizzati tramite elettroforesi su gel di poliacrilamide al 6% in un apparecchio per il sequenziamento, visualizzati per colorazione argentica, escissi dal gel e purificati tramite ulteriori cicli di amplificazione ed elettroforesi; in seguito, i frammenti di DNA purificati saranno sottoposti a sequenziamento e alla ricerca dell’omologia di sequenza del DNA nelle banche dati disponibili al fine di identificare il gene parentale del (o dei) prodotto(i) di amplificazione isolato(i). I risultati ottenuti dovranno essere confermati utilizzando tecniche più stringenti come il Northern blot o la PCR semi-quantitativa multiplex in presenza di “primers” specifici. Contemporaneamente saranno studiati i parametri di crescita e sopravvivenza cellulare, l'attività mitocondriale nonchè l'attivazione di caspasi o altri enzimi coinvolti nei processi di morte cellulare programmata, utilizzando appositi kit o coloranti che prevedono l'utilizzo di lettori ELISA e di fluorimetri, come MTS-tetrazolio per la proliferazione cellulare, JC-1 per il potenziale di membrana mitocondriale, e gli specifici kit caspase-glo per l'attività delle caspasi