Effetto di componenti del microambiente sull'espressione genica di cellule di epitelio mammario umano tumorale ed immortalizzato

Progetto: Research project

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Description

Il presente progetto di ricerca rappresenta una continuazione di quello condotto negli anni precedenti, ed è focalizzato sullo studio del ruolo di alcune componenti del microambiente colturale, collagene tipo V, cadmio e "parathyroid hormone-related protein" (PTHrP) sull'espressione genica di cellule di carcinoma mammario umano in coltura e di epitelio mammario non tumorale ma "immortalizzate". In particolare lo studio sarà focalizzato sull'individuazione di geni differenzialmente espressi in risposta alla somministrazione dei diversi fattori nel microambiente, tramite esperimenti di "differential display"- e "semi-quantitative multiplex" PCR.

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Sulla base di dati ottenuti e pubblicati negli anni precedenti, nel presente progetto si valuterà l’influenza di alcune componenti del microambiente colturale, collagene tipo V, cadmio e "parathyroid hormone-related protein" (PTHrP) sull'espressione genica di cellule di carcinoma mammario umano in coltura e di epitelio mammario non tumorale ma "immortalizzate". In particolare lo studio sarà focalizzato sull'individuazione di geni differenzialmente espressi in risposta alla somministrazione dei diversi fattori nel microambiente, tramite esperimenti di "differential display"- e "semi-quantitative multiplex" PCR. Le analisi sperimentali saranno condotte sulle linee cellulari neoplastiche MDA-MB231 e 8701-BC e sulla linea cellulare non tumorale da epitelio mammario umano HB2. Per lo studio degli effetti dei diversi fattori sull'espressione genica, si seguiranno i protocolli di "differential display-PCR" (DD-PCR) pubblicati da Sokolov and Prockop (Nucl Acid Res 19,4009,1994) e Doss (BioTechniques 21,408,1996), già messi a punto nel laboratorio del proponente (Luparello et al., DNA Cell Biol 16,1231,1997; J Cell Sci 116,2421,2003; Sirchia et al., Biol Proced Online 5,222,2003), tramite i quali i cDNA di geni differenzialmente espressi vengono identificati a seguito di analisi di sequenze interne usando esameri "random" per la retro-trascrizione degli RNA e "primers" arbitrari per l'amplificazione. I prodotti di amplificazione saranno analizzati tramite elettroforesi su gel di poliacrilamide al 6% in un apparecchio per il sequenziamento e visualizzati per colorazione argentica (Luparello et al., Promega Enotes 2000). Le bande relative ai prodotti di amplificazione differenzialmente espressi saranno escisse dal gel e purificate tramite ulteriori cicli di amplificazione ed elettroforesi; in seguito, i frammenti di DNA purificati saranno clonati in vettori opportunamente scelti (Sirchia et al., Promega Enotes 2001) per la determinazione della sequenza. La ricerca dell'omologia di sequenza del DNA sarà effettuata utilizzando le banche dati disponibili "on-line" al fine di identificare il gene parentale del (o dei) prodotto(i) di amplificazione isolato(i). I risultati ottenuti tramite gli esperimenti di DD-PCR dovranno essere confermati utilizzando tecniche più stringenti di analisi dei livelli di RNA, come il Northern blot o la già descritta tecnica di PCR semi-quantitativa relativa "multiplex" in presenza di "primers" specifici e, in caso di conferma dell'espressione differenziale, potranno essere condotti ulteriori studi a livello di proteina .
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/05 → …

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